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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是多发于中老年人的一种神经退行性疾病,临床症状主要表现为静止性震颤、僵直、运动迟缓及平衡障碍等。病理变化为选择性的黑质致密部(substantia nigral pars compacta,SNpc)多巴胺能神经元进行性的变性坏死、纹状体内的多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT)密度及多巴胺(Dopamine,DA)含量降低。目前临床上的治疗方法主要是多巴胺替代治疗,并不能延缓或逆转疾病进程。所以很多研究机构致力于延缓或逆转多巴胺能神经元退行性病变,主要包括细胞移植,基因治疗以及神经营养因子等,但是应用于临床还有一定的距离。寻找小分子化合物以刺激内源性的神经营养因子表达上调可能是延缓或逆转疾病进程的另一种途径。
地黄是祖国医学中常用的一种滋阴中药,多用于神经退行性疾病的治疗,包括帕金森病及阿尔茨海默病等。梓醇是地黄多种环烯醚帖类化合物中含量最高的一种。本文主要阐述了梓醇的分离提取、对拟帕金森病模型的保护作用以及部分作用机制的探讨。
梓醇的分离提取,我们采用的方法是甲醇回流,乙酸乙酯萃取除去脂溶性成分,活性炭柱层析,硅胶柱层析以及重结晶,分离得到梓醇,得率为0.2％,经13C-NMR,旋光度鉴定结构正确,HPLC鉴定纯度>95％。
由于帕金森病本身是一种慢性疾病,而梓醇也需要较长的时间起作用,所以我们选用一种损伤时间较长而又恢复较慢的动物模型,即MPTP/丙磺舒联合应用的拟帕金森病小鼠模型。通过rota-rod行为学分析,模型小鼠的运动功能明显低于正常小鼠,梓醇能明显上调模型小鼠的行为学成绩；高效液相电化学检测器(High performance liquid chromatography-electrochemical detector,HPLC-ECD)测定分析显示模型小鼠纹状体内的DA及其主要代谢产物(dihydroxy-phenyl acetic acid,DOPAC,homovanillicacid,HVA)含量明显降低,梓醇可以显著上调纹状体内DA及其主要代谢产物(DOPAC和HVA)的含量；免疫组织化学及体视学分析结果显示,模型小鼠的SNpc内酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元明显减少,梓醇能明显增加模型小鼠SNpc内TH阳性细胞数；放射自显影显示梓醇能明显提高模型小鼠的纹状体内降低的DAT密度；单位点竞争结合分析法发现梓醇并不占领多巴胺受体的结合位点；酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)显示梓醇能够明显上调模型小鼠纹状体内胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derivedneurotrophic factor,GDNF)及脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophic factor,BDNF)含量。
在MPP+损伤的原代培养的中脑多巴胺能神经元中,梓醇预保护24h能够明显上调减少的TH阳性细胞数及缩短的轴突长度,并呈现良好的剂量效应。逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcriptase Polymerase ChainReaction,RT-PCR)发现梓醇可以上调MPP+损伤后的中脑培养系统中GDNF及BDNF mRNA表达及BV2细胞中的大脑多巴胺神经营养因子(cerebral dopamine neurotrophic factor,CDNF)mRNA表达。通过K252a阻断BDNF受体TrkB后,梓醇的保护作用减弱；PP1阻断GDNF受体RET激酶后,梓醇的保护作用减弱(TH阳性细胞数)或消失(轴突长度)；抗GFRα1中和抗体阻断后,梓醇的保护作用完全消失。
综上所述,梓醇对MPTP慢性小鼠模型及MPP+损伤的中脑多巴胺能神经元均具有保护作用,而且这种保护作用部分是通过上调GDNF、BDNF而实现的,亦可能与上调CDNF表达有关。提示梓醇与临床现有药物的作用机制不同,有可能会延缓疾病进程,为治疗PD的药物开发提供了一条新的途径和实验依据。