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东方田鼠(Microtus fortis)属啮齿目、仓鼠科、田鼠亚科、田鼠属,主要分布在我国,以及和我国接壤的俄罗斯、朝鲜、蒙古等某些地区。20世纪70年代以来,东方田鼠在洞庭湖区暴发成灾,不仅对当地的农林业造成巨大的损失,在迁移时还经常引发钩端螺旋体、流行性出血热等病疫。同时,东方田鼠还是重要的实验动物资源,我国学者现已利用东方田鼠构建出抗血吸虫病、糖尿病和卵巢癌等多种模型。对东方田鼠的生态防控以及作为实验动物的资源利用,都需要对其种群遗传结构进行先行研究。
线粒体DNA和Y染色体序列是研究物种母系和父系遗传进化史的有效工具。田鼠属包含60多个物种,进化速度非常快,是研究系统进化的好材料。近年来,研究者们根据mtDNA序列研究田鼠系统进化关系,并已测出田鼠属Microtus kikuchii和Microtus levis的mtDNA基因组全序列。父系遗传结构仅在人类群体遗传学研究中被广泛应用,而在其他哺乳动物中研究很少。
本课题采用长片段PCR(LA-PCR)和PCR引物步移测序等方法,首次测得了东方田鼠长江亚种(Microtus fortis calamorum)线粒体基因组全序列和Y染色体序列,主要结果如下:
1.东方田鼠长江亚种线粒体基因组为双链环状分子,序列总长为16310bp,GenBank登录号为JF261175;包含了与其他脊椎动物一致的37个基因(13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因)和1个控制区(CR)。其基因组组成有很强的AT偏向性,全线粒体序列H-链的碱基百分含量为:A%(32.6)>C%(27.7)>T%(26.2)>G%(13.4),A+T%(58.8)>G+C%(41.1)。
2.东方田鼠长江亚种mtDNA的13个蛋白质编码基因最常用的起始密码子是ATG(COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND4L、ND4、ND6、Cytb基因),其次是ATT(ND3和ND5)。ND1和ND2基因比较特殊,起始密码子分别是GTG和ATA。COX1,COX2,ATPase8,ATPase6,ND3,ND4L,ND5和Cytb基因的终止密码子是TAA;ND2和ND6基因的终止密码子是TAG;另外,COX3和ND4以不完整的T作为终止密码子。
3.东方田鼠长江亚种mtDNA的22个tRNA基因中,有21个可以折叠成标准的三叶草二级结构;tRNAser(AGY)仅有59bp,二级结构缺少DHU环,这种tRNA结构在其他啮齿类动物中也很常见。
4.东方田鼠长江亚种mtDNA控制区的结构包括三个部分:两个终止序列区(ETAS-1和ETAS-2)、中央保守区(Central Domain)和保守序列区(CSB-1)。但与已报道的两个田鼠种一样均没有发现CSB-2和CSB-3。
5.东方田鼠长江亚种mtDNA的L-链复制起始区(OL)长度为35bp,可以形成茎环结构,与Microtus kikuchii和Microtus levis比较发现,其长茎以及相邻的序列十分保守。这3种田鼠的长茎相邻的保守序列为5’-TAAGG-3’,而其他哺乳动物为5’-GCCGG-3’。
6.6种啮齿类动物线粒体DNA H-链的12个蛋白编码基因序列ML法和Bayesian法系统进化树表明,东方田鼠属于田鼠属的亚洲谱系。田鼠属5个种(18条序列)线粒体DNA Cytb基因序列的ML法系统进化树表明,东方田鼠与Microtus.middendorfii组成姐妹群。
7.首次测得了东方田鼠长江亚种和指名亚种Y染色体上的7300bp序列,比对这两个亚种的序列后发现4个SNPs位点。
本论文测出了东方田鼠线粒体基因组全序列和Y染色体上部分序列,这将为我国东方田鼠的母系和父系遗传结构研究打下坚实基础;此外,提出了一种新的获得Y染色体序列的策略。