【摘 要】
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背景三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种预后较差的侵袭性肿瘤,因此探寻新的治疗靶点很有必要。miR-497在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的组织和细胞中表达降低,然而目前miR-497在TNBC中的作用和机制还不清楚。通过生物信息学预测,我们发现miR-497与YAP1的3’-UTR存在互补结合序列,提示miR-497可能在TNBC细胞的YAP1
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背景三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）是一种预后较差的侵袭性肿瘤,因此探寻新的治疗靶点很有必要。miR-497在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的组织和细胞中表达降低,然而目前miR-497在TNBC中的作用和机制还不清楚。通过生物信息学预测,我们发现miR-497与YAP1的3’-UTR存在互补结合序列,提示miR-497可能在TNBC细胞的YAP1基因调控机制中起重要作用。YAP1是Hippo通路的一个主要下游传感器,主要被鉴定为癌基因。许多研究证据表明,YAP1的失调导致包括TNBC在内的肿瘤发生。然而YAP1在TNBC中的转录后调控机制目前仍然不太清楚。目的本实验主要研究miR-497在TNBC中的潜在作用和可能的机制。方法收集36例TNBC病人的癌组织及癌旁非癌组织,采用qRT-PCR检测miR-497在TNBC癌组织与癌旁非癌组织中的表达情况,同时收集患者的临床病理资料及预后信息。分析miR-497表达的差异和临床病理分期及预后的关系。我们检测并比较了miR-497在MCF10A及乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SKBR3中的表达。为研究miR-497在TNBC乳腺癌中的作用,在乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞中转染miR-497mimics和阴性对照（NC）,进行细胞克隆实验、MTT实验以及transwell细胞迁移实验。另外,我们还通过流式细胞检测技术检测了miR-497对细胞周期的影响,通过流式凋亡实验检测了miR-497对细胞凋亡率的影响。为探讨YAP1在miR-497对TNBC产生作用过程中的角色,我们采用qRT-PCR和Western blot方法检测36对TNBC组织和TNBC细胞系中YAP1的表达,并将miR-497-mimics-NC转染到MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中,检测转染48h后YAP1 mRNA和蛋白水平。最后用荧光素酶报告分析miR-497是否直接靶向作用YAP1。结果检测36例TNBC病人癌组织及其相应的癌旁非癌组织中miR-497的表达,结果显示:miR-497在27例TNBC组织（27/36,75%）中的表达低于其癌旁组织。miR-497与TNBC病人分期及淋巴结转移的相关性显示:病理分期越高,miR-497的表达越低（Stage-1+Stage-2,Stage-3,P<0.05）。淋巴结转移越严重,miR-497的表达越低（N0 VS N1,P=0.0360,N1 VS N2,P=0.0374,N0 VS N2,P=0.0371）。统计生存期结果表明:相对于miR-497高表达组,miR-497低表达组的总生存期更短、预后更差,两者数据差异有统计学意义（P<0.05,n=36）。与正常的MCF10A细胞系相比,miR-497在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7和SKBR3中表达水平更低;在转染miR-497 mimics后,MDA-MB-231、MDA-MB-468的细胞克隆形成、增殖和迁移能力均受到抑制,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞转染miR-497mimics后进行流式凋亡实验,结果显示细胞凋亡率miR-497组高于对照组（NC组）。与正常组织相比,TNBC组织中YAP1 mRNA和蛋白质水平明显升高（P<0.001）。与MCF-10A正常细胞系相比,YAP1 m RNA和蛋白质水平在MDA-MB-231,MDA-MB-468细胞中显著升高（P<0.001）。转染miR-497 mimics后,MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中的YAP1 mRNA和蛋白质水平显著受到抑制（P<0.001）。野生型YAP1组在293T细胞中加入miR-497mimics后,荧光素酶活性下降（P<0.01）,而突变型YAP1组则无显著差异。结论本研究表明,miR-497在TNBC组织和细胞中表达下调,并通过直接调节YAP1的表达抑制细胞增殖和迁移,表明miR-497可以作为TNBC潜在的治疗靶点。
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