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汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染在人类可引起的严重的死亡率高达2%-10%的肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),全球每年约有100,000病例,其中90%以上发生在我国,陕西省为HFRS的高发区。HFRS患者的主要临床表现为发热、出血、血小板数量下降和急性肾功能不全。由于HTNV感染在宿主啮齿类动物上无疾病表现,因缺乏合适的动物模型,目前对于HTNV感染导致HFRS的致病机制尚不清楚。血小板功能障碍和毛细血管内皮细胞损伤为HFRS患者的主要病理表现,有研究表明,过度活化的免疫应答和炎症反应引起的“细胞因子风暴”可能是导致HFRS致病的机理之一。但目前对于HTNV感染通过怎样的机制引起细胞因子产生以及如何诱发“细胞因子风暴”尚不清楚。在我们前期工作中,用Luminex技术检测了HFRS患者血清中多种细胞因子的表达,其中CXCL10是表达最高的一种细胞因子。CXCL10又称为IFN-γ诱导蛋白10,是CXC趋化因子家族的成员,主要由内皮细胞,上皮细胞和角质形成细胞分泌产生。CXCL10与受体CXCR3结合后,可趋化淋巴细胞至感染发生部位,还可介导凋亡,细胞生长以及血管生成。在其他病毒感染性疾病,如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、流感病毒、呼吸道轮状病毒、鼻病毒、登革病毒等感染性疾病中,CXCL10均急剧升高,并与疾病的进展及严重程度相关。CXCL10可趋化淋巴细胞至感染发生部位,发挥抗感染的功能;也可作为“细胞因子风暴”中的一员加重机体炎症反应,趋化淋巴细胞至病毒感染的靶细胞,引起靶细胞发生免疫病理损伤。所以,cxcl10究竟是起保护宿主的作用还是起损伤宿主的作用取决于宿主的免疫状态及其基因背景。在htnv感染模型中,尚不清楚cxcl10可能发挥的作用。有研究发现很多信号通路如jak-stat途径、pi3k/akt途径以及traf2/tak1途径可调控cxcl10的表达,nf-κb、irf1和irf3等转录因子也被报道可结合于cxcl10的启动子区。尽管geimonen等报道htnv感染内皮细胞可引起cxcl10的表达升高,但是对于htnv通过怎样的途径调控cxcl10产生仍不清楚。在本课题第一部分中,我们将解决两个以下两个问题:(1)研究cxcl10在hfrs疾病中可能发挥的作用;(2)htnv通过怎样的信号转到途径诱导cxcl10的产生。首先,我们收集了hfrs患者的血清,检测hfrs患者血清中cxcl10的含量,并分析cxcl10的含量与病情之间的关系。随后建立体外htnv感染原代内皮细胞模型,探索cxcl的产生来源,并研究在内皮细胞中,htnv调控cxcl10产生的可能的分子机制。在本研究中,我们发现,hfrs患者血清中cxcl10表达急剧升高,在hfrs发病急性期尤为显著。通过相关性分析我们发现cxcl10与hfrs患者的白细胞计数、尿素氮和血清肌酐呈正相关,与血小板计数呈负相关,且血浆病毒载量高的患者其cxcl10的水平也高。随后通过检测hfrs外周血淋巴细胞各亚群表面cxcl10受体cxcr3的表达水平,发现在hfrs发病急性期,单核细胞表面cxcr3急剧升高,提示在发病急性期,高水平的cxcl10可能可诱导单核细胞至内皮细胞。在体外实验中我们发现,htnv感染后的原代内皮细胞可表达大量的cxcl10。而且,htnv并非通过其病毒蛋白调控cxcl10的表达,而是通过其病毒rna中的dsrna结构,激活tlr3、rig-i和mda-5途径,引起转录因子nf-κb和irf7发生磷酸化和核转位,随后nf-κb的亚基p50和p65以及irf7结合于cxcl10的启动子区,调控cxcl10的转录过程。这些研究有助于我们理解cxcl10及其参与其中的“细胞因子风暴”在病毒感染性疾病中的作用,可更好的为hfrs的治疗提供理论依据。il-33是il-1细胞因子家族的新成员,以往研究发现il-33是“孤受体”st2的配体。在细胞处于静止或凋亡状态下,il-33可作为转录因子存在与细胞核内,当细胞发生坏死,il-33则可从胞内释放。因此,il-33被认为是“警报素”,作为危险相关模式分子(danger-associatedmolecularpattern,damp)家族的成员,il-33的释放可警示免疫系统机体受到感染或损伤。研究发现,il-33可激活th2介导的免疫反应,促进th2相关的细胞因子,如il-4、il-5和il-13的产生。在以th2免疫应答介导的疾病中,il-33可引起内皮细胞和上皮细胞发生炎症反应。il-33的受体st2由于编码后对蛋白的剪切不同,可形成三种不同的蛋白剪切体,分别为膜表面st2l、膜表面变体型st2v和分泌至胞外的可溶型sst2。可溶型sst2可作为il-33的诱饵受体,竞争il-33与st2l的结合,中和il-33/st2l途径激活后可产生的生理或病理效果。st2l与il-33结合后,st2l与il-1受体辅助蛋白(il-1raccessoryprotein,il-1racp)形成复合体,募集myd88,激活mapk和nf-κb途径,促进促炎因子的释放。很多研究报道了il-33/st2途径在不同疾病中的表达及作用。在呼吸道炎症疾病、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病中,il-33/st2途径参与炎症病理损伤的发生过程。然而在hfrs中,il-33/st2如何调控免疫反应仍不清楚。在本课题的第二部分中,我们将解决以下两个问题:(1)研究il-33/st2途径在hfrs中如何发挥免疫调节的作用;(2)研究il-33/st2与htnv感染协同作用诱导内皮细胞炎症反应的分子机制。首先,我们收集hfrs患者血浆,检测其血浆中il-33及sst2的含量,并分析二者与hfrs患者病情的相关性。随后,在体外htnv感染内皮细胞模型中,检测il-33/st2对内皮细胞发生炎症反应的调控。最后,应用体外htnv感染内皮细胞模型探索il-33/st2与htnv感染协同调控内皮细胞炎症反应的分子机制。在本研究中,我们发现il-33及其诱饵受体sst2在hfrs血浆中均高表达。通过相关性分析发现,il-33与sst2与患者病情严重程度均呈正相关,且二者含量之间也呈正相关。随后,我们在体外htnv感染内皮细胞模型中发现,il-33可通过st2介导的途径促进htnv感染的内皮细胞产生大量的促炎细胞因子,引起“细胞因子风暴”,促进内皮细胞发生炎症反应。而sst2则可抑制内皮细胞炎症反应的发生。而且,il-33和htnv可通过共同活化nf-κb途径达到协同促进炎症反应的作用。该研究提示IL-33可能是HTNV感染导致“细胞因子风暴”的诱发因子,而该炎症反应的过程可被sST2抑制。IL-33/ST2共同调控HTNV感染后的免疫应答,为治疗HFRS提供了新的思路。