【摘 要】
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蛋白质的异源表达是生命科学研究的重要手段,也是工业生产蛋白制品的重要方法。曲霉作为真核微生物,兼具蛋白翻译修饰的能力和操作成本低的优点,因此有潜力成为优良的外源蛋
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蛋白质的异源表达是生命科学研究的重要手段,也是工业生产蛋白制品的重要方法。曲霉作为真核微生物,兼具蛋白翻译修饰的能力和操作成本低的优点,因此有潜力成为优良的外源蛋白表达宿主,但现有的表达模式大都以碳源为诱导剂,可选启动子种类有限,且调控严密性欠佳。与常用霉菌表达宿主不同,构巢曲霉具有生长快、重组效率高、遗传代谢背景清晰等特点,但尚未被开发为异源表达用宿主。本课题的最终目标是将构巢曲霉开发为蛋白表达宿主,使其能利用廉价的硝酸盐/铵盐为诱导剂和抑制剂,只需适当的氮源比例即可实现自诱导,从而达到在表达宿主和表达模式上有价值的创新。本文作为大课题的重要组成部分,主要聚焦于构巢曲霉硝酸盐同化途径中某些关键基因的表达特点,从中发掘出受硝酸盐诱导水平高,且受铵盐抑制明显的适合蛋白表达的核心元件——启动子。并尝试对此启动子进行进一步优化,使其更适于蛋白表达应用。具体研究结果如下:利用启动子融合报告基因uidA(GUS蛋白)的方法,首先比较了氮源同化途径中三个关键酶(硝酸盐转运酶、硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶)各自对应的编码基因nrtA、niaD和niiA的启动子响应氮源的能力,发现硝酸盐转运酶nrtA启动子显示出受硝酸盐诱导活性较高、铵盐抑制严密性更好的特点,因此选择nrtA基因启动子作为外源蛋白表达载体的启动子。为了进一步认识nrtA启动子,对其进行了详细的表征。首次对nrtA启动子的转录因子AreA和NirA的转录调控作用进行了体外和体内的分析,发现nrtA启动子区域的有效长度为1477bp,其中包含N1/N2、N3、A4、A5、A6等五个重要的转录调控因子结合位点。最后,根据nrtA启动子重要的转录操控位点和核心区域的分布,将启动子序列进行了改造,优化后的启动子诱导活性提高了两倍,调控严密性无明显变化。最终,本实验构建了一种能应用于霉菌表达表达外源蛋白的新型启动子元件,该启动子以廉价氮源为诱导剂,活性高且调控严密,培养初期按比例添加硝酸盐和铵盐作为氮源后,整个蛋白表达过程可实现自诱导,是一种全新的且具有一定应用潜力的真核表达体系开关。
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