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目的:
克隆刚地弓形虫RH株速殖子棒状体蛋白（rhoptryprotein，ROP）18基因编码序列，进行原核表达并制备多克隆抗体，采用间接免疫荧光技术(Indirectimmunofluorescenceassay，IFA)技术和免疫印迹(Westernblotting)技术检测不同时间ROP18蛋白在虫体内分布及表达量的变化，为深入研究ROP18在弓形虫入侵细胞中的作用提供基础。
方法:
根据ToxoDB基因库中ROP18基因序列，DNAstar软件设计并合成1对特异性引物。体外培养并收集弓形虫RH株速殖子，提取其总RNA，经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)得到弓形虫cDNA。以cDNA为模板，运用聚合酶链反应(PCR)技术扩增ROP18基因片段，分别构建重组质粒ROP18/pTG19-T和ROP18/pET-28a(+)，经PCR和酶切鉴定后，在大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株中诱导表达。采用KCl染色切胶纯化法纯化重组ROP18蛋白。
纯化的重组ROP18蛋白经皮下注射免疫家兔，制备其兔多克隆抗体，采用Westernblotting技术和IFA技术对多克隆抗体进行鉴定。
选择不同实验时间点，应用IFA和Westernblotting技术定位和检测ROP18在弓形虫速殖子体内的分布与表达。
结果:
从弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增出1665bp的ROP18基因片段成功构建重组质粒ROP18/pET-28a(+)，并在Rosetta(DE3)菌中大量表达，以包涵体形式存在。SDS-PAGE结果表明，67kDa处有一条明显的蛋白表达条带，与理论推测大小一致。采用KCl染色切胶纯化法获得纯化的目的蛋白。
以纯化的重组蛋白免疫家兔获得高效价的多克隆抗体。经Westernblotting技术检测出弓形虫RH株速殖子在55kDa处有特异性条带，IFA技术检测速殖子内ROP18分布于虫体前端胞质内，与棒状体位置基本一致，表明成功制备ROP18多克隆抗体。
IFA技术清晰可见不同时间点ROP18在弓形虫体内的分布，随着感染时间的延长，绿色荧光逐渐增强;采用Westernblotting技术检测相应时间点ROP18表达量的变化，结果表明，随着感染时间延长ROP18表达量逐渐升高，与IFA结果一致。
结论:
成功构建了重组质粒ROP18/pET-28a(+)，并将其导入大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)中得到高效表达，通过制备多克隆抗体，利用Westernblotting技术和IFA技术对多克隆抗体进行鉴定，证明所制备的抗体具有较好特异性。初步应用IFA技术和Westernblotting技术定位和检测不同时间弓形虫速殖子体内ROP18的分布和表达，为进一步开展ROP18生物学功能及其在虫体入侵细胞中的作用提供了技术支撑。