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目的:
探讨蛋白酶体抑制剂左旋紫草素单用及联合顺铂对肺癌细胞系A549体外增殖和凋亡的影响,观察左旋紫草素是否增加肺癌A549细胞对顺铂的敏感性,对相关机理进行初步研究。
方法:
1.左旋紫草素单用及联合顺铂对纯化的20S蛋白酶体活性的影响对照组:DMSO处理;左旋紫草素组:1umol/L,10 umol/L,20 umol/L;左旋紫草素联合顺铂组:10umol/L(左旋紫草素)+2ug/ml(顺铂)、10umol/L(左旋紫草素)+4ug/ml(顺铂),10umol/L(左旋紫草素)+8ug/ml(顺铂)利用荧光分度仪,在激发波长:380nm,发射波长:460nm的条件下测定其荧光底物的荧光值,计算出左旋紫草素对20S蛋白酶体活性的抑制率。
2.MTT法测左旋紫草素单用及联合顺铂对肺癌A549细胞的生长抑制效应第一组:空白对照组,不给予任何处理;第二组:顺铂组(一系列不同浓度的顺铂);第三组:左旋紫草素组(2、4umol/L);第四组:在第二组基础上联合左旋紫草素(2umol/L);第五组:在第二组基础上联合左旋紫草素(4umol/L)。将细胞接种于96孔板,分别作用24小时后,加入MTT和二甲基亚砜,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值,根据细胞抑制率公式计算:抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100％。
3.流式细胞术观察左旋紫草素单独及联合顺铂对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用及细胞周期再分布的影响实验分组:对照组;4 umol/L左旋紫草素组;4mg/L顺铂组;4 umol/L左旋紫草素组联合组+4mg/L顺铂组。将细胞处理后上机检测。
4.RT-PCR检测切除修复基因-1(ERCC-1)的转录水平
实验分组:对照组:4mg/L顺铂组;4mg/L顺铂+2umol/L左旋紫草素联合组:4mg/L顺铂+4umol/L左旋紫草素组联合组。作用24小时后提取总RNA,RT-PCR反应后行琼脂糖凝胶电泳,了解ERCC-1的水平.
结果:
1.左旋紫草素单用及联合顺铂对纯化的20S蛋白酶体活性的影响
左旋紫草素从1umol/L开始即对20S蛋白酶体Chymotrypsin-liked产生抑制效应,且存在剂量依赖关系,随着剂量增加抑制效应逐渐增加(IC50为12.5 umol/L)。左旋紫草素联合顺铂组与单独用左旋紫草素组对纯化的20S蛋白酶体活性的抑制效应无明显差异。
2.MTT法检测肺癌A549细胞抑制率
不同浓度顺铂组的抑制率分别为:7.31％±0.49％、12.48％±0.82％、18.26％±1.22％、26.62％±1.34％、35.12％±1.345。随着顺铂浓度升高肺癌A549细胞抑制率增高,不同浓度顺铂组肺癌A549细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P＜0.05)。左旋紫草素组的抑制率:22.50％±1.01％、34.12％±1.2296。左旋紫草素(2umol/L)联合顺铂组的抑制率:33.12％±0.8696、39.21％±0.76％、43.19％±0.82％、56.21％±0.54％、62.28％±0.62％。左旋紫草素(4umol/L)联合顺铂组的抑制率:44.23％±0.16％、49.18％±0.78％、56.32％±1.77％、62.28％±0.54％、80.28％±1.21％。左旋紫草素联合顺铂组肺癌A549细胞的增殖抑制率高于顺铂组及左旋紫草素组,差异有统计学意义(P＜0.05),随着左旋紫草素浓度增高细胞的增殖抑制率增高,两联合组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.流式细胞术分析肺癌A549细胞凋亡率及细胞周期
对照组为3.21％±0.24％;顺铂组为14.4696±1.565,左旋紫草素组为35.62％±1.37％;左旋紫草素联合顺铂组为58.375±0.97％。左旋紫草素与顺铂联合能有效诱导肺癌A549细胞凋亡,其诱导的凋亡率高于对照组、顺铂组及左旋紫草素组,差异有统计学意义(P＜0.05)。左旋紫草素联合顺铂组S期细胞百分数显著增加,各组细胞周期分布差异具有统计学意义(P＜0.05)。
4.顺铂和左旋紫草素对肺癌A549细胞ERCC-1转录水平的影响
RT-PCR结果显示:顺铂组肺癌A549细胞ERCC-1mRNA相对表达量高于对照组,而顺铂和蛋白酶体抑制剂左旋紫草素联合作用,ERCC-1转录水平较顺铂组降低。
结论:
1.蛋白酶体抑制剂左旋紫草素可抑制肺癌A549细胞的生长,诱导细胞凋亡,与顺铂联合具有协同抑制效应。
2.左旋紫草素可能通过下调ERCC-1转录水平,阻断顺铂诱导的ERCC-1过表达所致的DNA损伤修复,增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性,从而增强顺铂的抗肿瘤作用。