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RNA干扰(RNA interference，RNAi)是1998年在线虫中发现的一种转录后基因沉默现象，是指由双链RNA引发的同源mRNA表达受阻或降低的过程，这一过程是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前利用RNA干扰进行的研究已经在植物，无脊椎动物，哺乳动物细胞中广泛开展起来，除了继续以低等生物为模型研究RNAi的机制外，在高等生物中的研究主要集中于基因功能，信号转导系统上下游分子相互关系以及基因治疗等方面。
斑马鱼(Danio rerio)是属于辐鳍亚纲(Actinopterygii)鲤科(Cyprinidae)短担尼鱼属(Danio)的一种硬骨鱼。斑马鱼由于产卵量高，胚胎体外发育、透明易于观察，有较完善的胚胎和遗传学操作技术，品系资源丰富等优点，已被作为一种重要的模式生物广泛的应用到发育生物学、遗传学、药物学、毒理与环保等方面的研究并取得了令人瞩目的成果。
然而，作为一种越来越受人们关注的模式生物，斑马鱼在基因功能方面的研究远远没有达到像在低等生物，小鼠中的程度，还亟需深入探讨。RNAi的出现吸引了诸多研究者在斑马鱼中进行基因功能的研究，迄今为止，关于在斑马鱼中RNAi研究的报道没有得到一致的结论，甚至相互矛盾。那么RNAi到底能否在斑马鱼中发挥抑制基因功能的作用呢？
本研究利用斑马鱼自身的H1，U6启动子以及T7转录系统分析RNAi在斑马鱼中的应用，以期建立在斑马鱼中通过体内转录产生持续抑制的RNAi的研究平台，为斑马鱼中基因功能及信号网络的研究打下良好的研究基础。本论文主要进行了如下几个方面的研究：
1.斑马鱼H1，U6启动子的克隆及转录活性分析：利用斑马鱼的H1RNA，U6 snRNA基因搜索斑马鱼数据库，找到搜索到H1启动子的三个序列和U6启动子的两个序列。将这些序列分别与人，鼠，鸡等物种的H1，U6启动子进行比较之后发现斑马鱼H1，U6启动子各有一个序列包含维持启动子活性所必需的三个保守性区域：DSE，PSE，TATA。将这两个启动子从斑马鱼基因组中克隆后，连接一段与H1 RNA和U6 snRNA基因长度相当的序列，注射到斑马鱼胚胎进行转录活性分析，结果表明本文作者克隆的斑马鱼H1，U6启动子可以很好的驱动小RNA的转录，而且可以驱动mRNA的表达。
2.斑马鱼H1，U6启动子驱动的shRNA载体在RNAi中的应用：为了分析斑马鱼H1，U6启动子在RNAi中的作用，本文作者针对外源基因GFP，内源基因No tail设计siRNA位点连接到斑马鱼H1，U6启动子上构成shRNA载体。首先通过与No tail基因串连的Luciferase载体共转染鲤鱼EPC细胞，结果表明克隆获得的H1和U6启动子能在鱼类细胞中转录shRNA并特异抑制靶基因的转录水平。然后将H1和U6启动子驱动的shRNA载体显微注射至斑马鱼受精卵后，结果显示shRNA载体能抑制靶基因的表达并导致相应的表型效应，通过荧光定量PCR，胚胎整体原位杂交检测mRNA的水平证实靶基因的转录水平显著降低。
3.T7系统应用到RNAi中所用载体的构建与验证：基于T7 RNA聚合酶/T7启动子系统的强大转录功能，本文作者分别构建T7 RNA聚合酶的表达载体pCMV T7R和用于表达shRNA的载体pT7shRNA。首先将pCMV T7R载体显微注射到斑马鱼受精卵后，筛选到性腺整合的转基因斑马鱼品系，通过注射T7驱动的bmp2b载体进行转录活性分析，显示该转基因品系可以稳定表达具有生物学活性的T7 RNA聚合酶。然后将pT7shRNA载体注射到该品系的F3代胚胎后RT-PCR检测到shRNA的体内转录，进而证实了该系统在斑马鱼中的可行性，为下一步进行RNAi分析打下了基础。
4.T7系统在RNA干扰中的应用：将pT7 shRNA载体显微注射到稳定表达T7 RNA聚合酶的斑马鱼品系F3代胚胎中，分别观察该系统对外源基因GFP和内源基因NTL的抑制效果。通过荧光显微镜的观察和荧光定量RT-PCR分析，外源基因GFP的表达水平下降了68％，而同时作为对照的化学合成siGFP在以2ug/ul注射到F3代胚胎时GFP mRNA的相对表达水平降低了40％；利用胚胎整体原位杂交对内源基因ntl的表达进行检测，显示有30％的胚胎在胚环部位的表达受到部分抑制。初步结果表明T7系统可以在斑马鱼中表达shRNA，抑制相应基因的部分表达。
综上所述，本研究首次克隆斑马鱼自身H1，U6启动子，分析其转录活性后构建了分别由这两个启动子驱动的shRNA载体，通过在鲤鱼细胞和斑马鱼胚胎中的分析发现此载体可以部分地抑制内外源基因的表达；首次利用噬菌体T7 RNA聚合酶/T7启动子系统在斑马鱼中进行RNAi的研究，结果证实该系统可以在斑马鱼胚胎中正常工作，而且构建的由T7启动子驱动的shRNA载体可以在表达T7 RNA聚合酶的斑马鱼品系中有效的抑制内外源基因的表达。本研究为RNAi在斑马鱼中的应用开辟了一个很好的研究基础，为更好的研究基因功能提供了广阔的前景。