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目的:骨骼肌在人体内分布比较广泛,且大多数位于接近体表的位置,在日常生活中损伤和疾病的发生率较高。骨骼肌缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,IRI）是一种常见的临床肌肉损伤类型,具有高致残率和高致死率的特点,严重的IRI给患者带来沉重的心理负担和经济负担。其常继发于机体的血管损伤,挤压综合征,筋膜室综合征,重建手术以及止血带的应用,目前对于IRI并没有有效的治疗方法。大麻素2型受体（cannabinoid type 2 receptor,CB2R）是内源性大麻素系统的重要组成成员,是一种分布于细胞膜表面的七次跨膜的G蛋白偶联受体。研究表明,激活CB2R可以减弱缺血再灌注（ischemia/reperfusion,IR）诱发的脑、心脏、肾脏和肝脏的损伤。结合我们课题组前期在大鼠骨骼肌挫伤模型中的研究发现,骨骼肌损伤后CB2R呈时间依赖性表达,并且激活CB2R后能够发挥抗炎和抗纤维化,进而促进骨骼肌损伤修复的作用。因此,我们推测激活CB2R也可能对骨骼肌的IRI具有保护作用。红系衍生的核因子2相关因子（NF-E2-related factor,Nrf2）是机体的一个重要的抗氧化应激因子,不仅调节着细胞内的氧化还原平衡,还参与了对细胞的增殖和分化的调控。大量的研究表明Nrf2在组织的损伤愈合过程中发挥着重要的作用。在本实验中,在体实验我们通过应用CB2R选择性激动剂AM1241和Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）小鼠,结合体外培养的C2C12细胞实验去证明激活CB2R是否可以减弱IR诱导的骨骼肌氧化应激性损伤和促进骨骼肌IRI后肌肉的早期再生,从而对骨骼肌的IRI发挥保护作用,并且证明这种保护作用是否是通过Nrf2途径得以实现的。研究方法:动物实验采用8-12周的雄性C57BL/6野生型小鼠（wildtype）以及以C57BL/6小鼠为背景的Nrf2-KO小鼠。野生型小鼠随机分为4组（Sham组,IR组,溶剂组,AM1241组）,Nrf2-KO小鼠随机分为4组（Sham组,IR组,溶剂组,AM1241组）,参照Crawford和Sonmez等使用牙齿矫正橡皮圈（orthodontic rubber bands,ORBs）制作小鼠骨骼肌缺血再灌注损伤模型,本实验给药采用预激动的方法,不同处理组于损伤前0.5h分别接受CB2R的激动剂AM1241（20mg/Kg）或溶剂腹腔注射,每天一次。分别于伤后1天和4天腹腔注射过量2%戊巴比妥钠（30mg/Kg）处死实验小鼠,每组每个时间段12只小鼠,另有6只健康小鼠作为对照（Sham组）。一部分样本用于形态学检测,进行H&E染色,MPO,MyoD,myogenin,CB2R和Nrf2的免疫荧光或免疫组织化学染色;一部分样本用于生物化学检测,主要包括MDA和SOD,用以评价小鼠损伤后骨骼肌的氧化应激水平;一部分样本用于干湿比重的检测,用于评定骨骼肌的水肿程度;一部分样本用于Western blotting检测,测定Nrf2、HO-1,MyoD和Myogenin的蛋白表达水平。体外实验采用C2C12成肌细胞培养,通过制作H2O2诱导C2C12细胞的氧化性损伤模型以及分化培养基（differentiation medium,DM）诱导C2C12细胞的分化模型,并制作了Nrf2-KD（Nrf2 known down）C2C12细胞。应用AM1241（1μM-30μM）或溶剂对其进行处理。CCK-8法检测细胞活力,通过流式细胞术检测细胞内的活性氧（reactive oxygen species,ROS）和细胞凋亡情况。通过qRT-PCR和Western blotting检测CB2R、Nrf2、MHC、myogenin的mRNA表达水平以及CB2R、Nrf2、HO-1、MHC、myogenin和cleaved caspase 3的蛋白表达水平。进行Nrf2和MHC的免疫荧光染色。用GraphPad Prism 6.0统计软件对各组数据进行单因素方差分析或者非配对t-检验分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果:动物实验中,与溶剂组相比,CB2R的激动剂AM1241处理后,1天时,小鼠骨骼肌的损伤程度减轻,中性粒细胞浸润数量减少,骨骼肌细胞肌浆溶解以及核丢失减少。骨骼肌的干湿比重降低。骨骼肌内MDA的水平降低,SOD的活力升高。4天时,单位面积内再生的肌管数量显著增加,MyoD和myogenin的蛋白表达水平显著升高,MyoD+和myogenin+的核比率显著增高。同时,与假手术组相比,IRI诱发了骨骼肌内的Nrf2和HO-1的表达,而AM1241处理后又进一步增加了Nrf2和HO-1的表达。与AM1241处理后的野生型小鼠相比,AM1241处理后的Nrf2-KO小鼠在1天时,小鼠骨骼肌的损伤程度恶化,中性粒细胞的浸润数量增加,骨骼肌细胞的肌浆溶解以及核丢失增加。骨骼肌的干湿比重增加。骨骼肌内MDA的水平升高,SOD的活力降低。4天时,单位面积内再生的肌管数量减少,MyoD和myogenin的蛋白表达水平降低,MyoD+和myogenin+的核比率降低。细胞实验中,1mM H2O2导致C2C12细胞的细胞活力下降了大约50%。与H2O2组相比,CB2R的激动剂AM1241处理后,C2C12细胞的细胞活力显著升高,细胞内ROS水平和细胞凋亡率以及cleaved caspase 3的水平都显著降低,并表现为剂量依赖性。AM1241能够促进Nrf2的表达以及核转位,并且促进了HO-1的表达。通过慢病毒敲减Nrf2以后,AM1241对H2O2诱导的C2C12细胞的细胞活力降低的保护作用部分减弱,并且其cleaved caspase 3的水平升高。在C2C12细胞的分化过程中,其融合指数（Fusion index）以及CB2R、Nrf2、MHC、myogenin的mRNA和蛋白水平都随着分化进程呈时间依赖性升高。与溶剂组相比,激活CB2R以后,C2C12细胞的融合指数升高,伴随着Nrf2、MHC、myogenin蛋白水平的升高。而Nrf2敲减以后,与AM1241处理的分化的Scr C2C12细胞相比,AM1241处理的分化的Nrf2-KD C2C12细胞的融合指数降低,伴随着Nrf2、MHC、myogenin蛋白水平的降低。结论:小鼠骨骼肌IRI愈合过程中,激活CB2R可以减弱IR诱导的骨骼肌的氧化应激性损伤和促进骨骼肌IRI后肌肉的早期再生,从而对骨骼肌的IRI发挥保护作用,该保护作用部分是通过Nrf2途径得以实现的。