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研究背景严重创伤已成为当今世界的公共健康问题，促进严重创伤应激后的胃肠动力恢复是护理和科研关注的焦点。重型颅脑损伤(severe head injury，SHI)在严重创伤中占首位，死亡率高达20%-50%。肠动力障碍(intestinal motility disturbance，IMD)是重型颅脑损伤的常见并发症，临床上以肠动力不足更为常见。肠动力不足不仅加重肠道内环境紊乱，导致细菌移位，肠内营养不耐受，还可引发多种并发症，直接影响救治效果和临床预后。因此，改善SHI后的肠动力不足，不仅有利于肠内营养的顺利实施，也是有效改善患者预后的重要治疗措施。肠神经系统(enteric nervous system，ENS)是保证胃肠道感觉、运动和分泌等复杂功能协调运行最重要的基础和核心，肠神经系统受损可能是SHI后肠动力不足的重要原因之一。有研究报道重型颅脑损伤后肠道平滑肌在缺血再灌注状态下发生细胞及周围组织结构损伤，最终引起肠道收缩模式改变。在MODS大鼠模型中观察到肌间神经丛内氮能神经和Cajal间质细胞(intestitial cell of Cajal，ICC)减少，导致兴奋与抑制失衡，小肠运动障碍。课题前期研究已发现，SHI后肠道ICC和平滑肌细胞均出现损伤，它们之间的缝隙连接蛋白Cx43表达降低，这些改变可能是引起重型颅脑损伤后肠动力不足的原因之一。但SHI后肠神经及神经递质的变化还缺乏相关的观察研究。因此，观察和分析SHI后肠动力不足ENS-ICC-平滑肌细胞网络调控通路中其上级调控系统肠神经递质在SHI后肠动力不足的作用，可为进一步深入揭示其机制提供理论依据。参与肠神经调控功能的主要兴奋性神经递质为乙酰胆碱(Ach)，抑制性神经递质一氧化氮(NO)。乙酰胆碱酯酶(AchE)在胆碱能神经元胞体内合成，是胆碱能神经元的特殊标志，与乙酰胆碱(Ach)的分布几乎平行，故常作为研究胆碱能神经元的标志或估计Ach含量的间接指标。一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是ENS重要的抑制性运动神经元，主要分布于肌间丛，能介导胃肠道平滑肌松弛，以左旋精氨酸(L-Arg)为底物，由一氧化氮合酶(NOS)催化生成。因此，本实验以AchE和NOS两大经典神经递质为主要观察指标，探讨以ENS为主线的重型颅脑损伤后肠动力不足的可能机制。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus Acidphilus，LA)是肠道重要的益生菌之一，属于乳酸菌家族，因其属于活性微生态制剂，能很好在胃肠道内发挥其优势功能而备受推崇。目前用于临床的微生态制剂多以活菌制剂为主，但活菌保存要求一定的低温条件，其存活率容易受存放条件和环境的影响、保质期短、活性不稳定，这些因素都在一定程度上影响了微生态制剂的应用。因此，培养分离益生菌，探究其不同成分的作用已成为改良用菌方式、优化微生态制剂的焦点。我们前期研究已证实嗜酸乳杆菌可明显改善SHI后小鼠肠动力不足，修复受损的ICC细胞网络，提高缝隙连接蛋白Cx43的表达水平等，但嗜酸乳杆菌及其不同成分对肠动力上级调控系统肠神经系统的影响还未见报道。研究目的及理论意义本研究拟从肠神经递质入手，初步探讨嗜酸乳杆菌对改善重型颅脑损伤后肠动力不足的可能机制。通过观察嗜酸乳杆菌培养分离后不同成分对重型颅脑损伤小鼠小肠AchE和NOS的影响及肠动力的影响，探讨嗜酸乳杆菌及不同成分对重型颅脑损伤上级调控系统----神经递质关键酶AchE和NOS的作用，初步探讨嗜酸乳杆菌对重型颅脑损伤后肠道神经递质的作用及不同成分对神经递质及肠动力作用的效果，分析对比嗜酸乳杆菌分不同成分对肠动力的改善效果和神经递质的作用，为认识嗜酸乳杆菌改善SHI后肠动力不足提供研究证据，也为临床治疗重型颅脑损伤后肠动力不足提供理论依据。研究方法①随机数字表法将320只C57雄性小鼠进行制模，制模成功共264只，(制模正常死亡率为30%左右)，分为创伤组(S组)和假伤组(I组)，每组各72只(n=72)，分为1，3，7d三个时相点，每个时相点24只小鼠，每天每时相点均分别灌胃嗜酸乳杆菌(LA)、嗜酸乳杆菌耗尽上清液(SCS)、活菌沉淀(P)和乳酸杆菌选择性培养基(MRS培养基)4种试剂，每组每种灌胃剂6只（小肠推进率检测制模成功120只，以相同方式分组）。②动物模型制作：采用feeney自由落体法方法并改进，建立小鼠SHI模型。制模后4h，待动物苏醒后方可灌胃，每天灌胃1次，每次0.5mL，观察记录小鼠一般情况及大便性状改变情况，于致伤后1、3、7d取全肠段丙酮固定，待指标检测。③应用免疫荧光和免疫组化检测ChAT阳性细胞的改变，酶组化染色检测其NOS阳性细胞活性改变、采用葡聚糖蓝灌胃，观察小肠运动功能的变化情况。结果1.嗜酸乳杆菌分离培养后成分对重型颅脑损伤小鼠小肠AchE的影响SHI组ChAT阳性细胞在伤后1d即出现形态和数量上的改变，创伤1d后，嗜酸乳杆菌组阳性细胞计数显著多于培养基对照组组(P＜0.01)；同时耗尽培养上清液组与培养基对照组与也存在统计学差异(P＜0.05)，与P组有统计学差异(P＜0.01)，但培养基对照组与活菌沉淀组无统计学差异(P＞0.05)；耗尽上清液组与嗜酸乳杆菌组无统计学差异(P＞0.05)，SCS，嗜酸乳杆菌组与活菌沉淀组有较显著统计学差异(P＜0.05～0.01)。创伤3d和7d阳性细胞计数均无明显统计学差异(P＞0.05)。假伤各组1d，3d，7d均无明显统计学差异(P＞0.05)。2.嗜酸乳杆菌分离培养后成分在相同时相点SHI组和I组ChAT阳性细胞计数的变化重型颅脑损伤组和假伤组在嗜酸乳杆菌灌胃后，1d时无明显统计学差异(P＞0.05)，创伤与假伤组在伤后3d， ChAT阳性细胞数目差异有统计学意义(P＜0.05)，7d后创伤组灌胃嗜酸乳杆菌后细胞恢复到稳定水平，与相同时相点假伤组差异无统计学意义(P＞0.05)。在灌胃耗尽上清液后，1d，7d损伤组和假伤组无统计学差异(P＞0.05)，3d时出现统计学差异(P＜0.05)。灌胃活菌沉淀后1d，损伤组与假伤组即出现明显的统计学差异(P＜0.01)，3d无明显统计学差异(P＞0.05)，7d时，损伤组与假伤组有统计学意义。(P＜0.05)。3.嗜酸乳杆菌分离培养后成分对小肠收缩功能的影响在SHI1d后，各组推进率在灌胃嗜酸乳杆菌各成分后未出现明显的统计学差异，3d后嗜酸乳杆菌组与培养基组之间出现显著的统计学差异(P＜0.01)，耗尽上清液组与培养基对照组间也出现统计学差异；7d时，嗜酸乳杆菌组与培养基对照组间的差异显著(P＜0.01)，与活菌沉淀组间也出现统计学差异(P＜0.05)，耗尽上清组组与培养基对照组间的差异显著(P＜0.01)。结论1.小鼠SHI后AchE活性降低，NOS活性增强，嗜酸乳杆菌对受损的ChAT阳性细胞起到修复和保护作用，能提高AchE的活性，并显著抑制NOS的活性，从而起到促进SHI后肠动力恢复的作用。2.ChAT在SHI后阳性细胞数出现明显变化，嗜酸乳杆菌和其耗尽培养上清液对受损的ChAT阳性细胞有显著的保护和修复作用，而活菌沉淀并不能对ChAT细胞的数量产生影响，SCS中可能存在着嗜酸乳杆菌发挥生物学效应的某种生物活性物质，能达到与合菌有相同的促进肠动力功效的作用，有效改善SHI后肠动力不足。3.NOS在SHI后其活性明显增强，嗜酸乳杆菌和其耗尽培养上清液能显著抑制NOS的活性，从而减少氮能神经对肠道运动的抑制效果，达到促进SHI后肠动力的作用。4.小肠推进率结果说明嗜酸乳杆菌和其耗尽上清液具有类似的促SHI后肠动力的作用，SCS对肠动力不足有积极的改善作用。