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硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)是在细胞表面和细胞外基质(extracellularmatrix)中广泛存在的一种多糖，它能与一系列的生长因子、趋化因子和白介素相互作用，进而在胚胎发育、细胞生长、炎症反应、凝血、肿瘤转移和病毒侵染等生理过程中发挥作用。肝素是一种临床上使用有70多年历史的抗凝血药物。葡萄糖醛酸C5异构酶(D-glucuronyl C5-epimerase，Glce)则是在硫酸乙酰肝素和肝素体内合成中的一个关键酶，它能将糖链中的葡萄糖醛酸异构为艾杜糖醛酸，从而赋予糖链结构上的柔性。同时艾杜糖醛酸也是硫酸乙酰肝素糖链识别众多信号分子的重要组成糖残基。生物体内，Glce的功能十分重要，Glce基因敲除小鼠胚胎致死，并伴随肾脏、肺和骨骼等发育缺陷。同时Glce能抑制小细胞肺癌和乳腺癌细胞的增殖，还参与到早期淋巴组织形态发生和B淋巴细胞成熟与分化。此外，我们课题组还发现在神经营养因子诱导下，Glce能够促进PC12细胞的神经突起的形成。 虽然Glce在生理病理过程中担任着关键角色，而且它是人基因组中唯一功能酶，没有其它同工酶，具有成为靶标分子的潜力。但是其晶体结构仍未有报道，为此我们纯化了人、大鼠、鸡、斑马鱼和果蝇5个种属中的Glce蛋白。由于尚无Glce蛋白同源结构的报道，我们采用硒代甲硫氨酸替代法首次成功解析了斑马鱼Glce的蛋白结构，以及Glce与肝素六糖的复合物结构。两种结构中，Glce均以稳定的二聚体形式存在。每个Glce单体可以分为N端β-发夹结构域、β桶型结构域和C端α-螺旋结构域。复合物结构中，Glce的α-螺旋结构域的带正电结合口袋能与一个带负电的肝素六糖通过大量的电荷相互作用和氢键相结合。根据结构分析和突变研究，我们确定了Glce的α-螺旋结构域中的酶活活性位点，它通过Tyr468、Tyr528和Tyr546这3个酪氨酸在葡萄糖醛酸C5位置上发挥去质子化和再质子化作用完成催化过程。 报道表明Glce的催化过程在体外是可逆的，但是在体内却是不可逆的。在体内糖链合成过程中，Glce催化的异构化修饰下游有多种O-硫酸化修饰。而且我们发现Glce能与2-O-磺酸基转移酶和6-O-磺酸基转移酶相互作用，复合物晶体结构中糖链上的这两种O-硫酸化修饰导致催化位点的糖环C5碳原子远离催化氨基酸，形成一种非活性状态。生化实验也揭示了下游产物上2位和6位O-硫酸化对Glce酶的反馈抑制作用。因此，糖链合成过程中与葡萄糖醛酸异构化偶联的下游O-硫酸化导致了Glce的催化过程在体内是不可逆，并造成硫酸乙酰肝素糖链上艾杜糖醛酸的累积。 此外，我们基于蛋白热稳定性实验和酶活检测实验，建立了Glce抑制剂的高通量筛选方法和计算机虚拟筛选方法，对Glce抑制剂发现进行了初步探索，共发现13个与Glce有相互作用的小分子化合物，但是其对Glce酶活抑制作用并不明显，有待进一步筛选。 这些结果进一步深化了我们对Glce在体内硫酸乙酰肝素和肝素合成中重要作用的认识，并且为靶向Glce的新药发现和其在肝素类药物的人工合成中的运用提供了帮助。