论文部分内容阅读
胃癌前病变(PLGC)是一类易发生癌变的胃黏膜病理学变化，在其基础上发生的胃黏膜细胞异型增生是胃癌发生的重要组织学基础。在国内胃癌发病率及死亡率的趋势逐年升高。目前根据病因而采取的一级预防目前难以实现，因此对胃癌前病变的防治则成为胃癌二级预防的重点。胃癌前病变的治疗国际上尚无统一规范及推荐药物；中药在本病的治疗上取得了一定的成绩，越来越受到国内外学者重视。魏品康教授总结四十余年临床经验，认为“痰浊内蕴”与胃癌前病变的产生密切相关，在此理论基础上，自创消痰和胃方（原名消痰养胃方）用于治疗胃癌前病变，临床结果表明该方能改善临床症状，逆转病理状态，但机制尚不明确。而现代研究证实胃癌前病变的发生主要是胃黏膜细胞凋亡紊乱所致，并且NF-κB通路与细胞凋亡密切相关。因此消痰和胃方是否通过调控NF-κB通路，影响PLGC胃黏膜细胞凋亡，最终逆转PLGC是本次实验重点探讨的问题。 目的： 以化学致癌物N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导为主的多因素造模法建立胃癌前病变大鼠模型，HE染色观察消痰和胃方对胃癌前病变大鼠胃黏膜组织病理学的影响；TUNNEL法检测消痰和胃方对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡指数的影响；采用免疫组织化学等技术检测消痰和胃方对胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白表达的影响；western blot检测消痰和胃方通过改变胃癌前病变大鼠胃黏膜组织NF-κB通路相关蛋白的影响，从而干预下游凋亡相关因子的表达，进一步促进胃癌前病变胃黏膜细胞凋亡，最终逆转胃癌前病变。 方法： 第一部分：70只雄性Wistar大鼠，6周龄，随机分为空白组及模型组。正常对照组15只，模型组55只。采用MNNG为主的多因素造模法建立胃癌前病变大鼠模型。每3天1次给予300μg/mL的MNNG灌胃，同时3天1次给予无水乙醇1ml灌胃，2天给予饮食1天禁食，每周三上午9AM夹尾使大鼠保持争夺激怒10min。总共32周。造模过程中死亡5只。32周后模型组随机取8只大鼠、空白组随机取1只大鼠的胃大弯处胃黏膜组织固定，石蜡包埋切片，HE染色，病理确认造模成功。 第二部分：将造模成功的雄性Wistar大鼠随机分为模型对照组、维酶素组、消痰和胃组。消痰和胃方药物组成：全方由制半夏15g、黄连9g、炒枳壳15g、桂枝9g、细辛6g、白芍15g、炙甘草6g等药物。消痰和胃组、维酶素组、模型对照组及正常对照组分别以6g/mL的中药水煎膏、维酶素混悬浊液、生理盐水（后两组）灌胃，持续6周。并每周相同时间记录大鼠体重变化情况。6周结束后，将胃大弯处胃黏膜组织固定,石蜡包埋切片,HE染色，观察组织病理学改变情况。 第三部分：雄性Wistar大鼠分组给药同第二部分。6周后，麻醉处死大鼠，将胃大弯处胃黏膜组织固定，石蜡包埋切片。免疫组化法检测胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞中Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白的表达。 第四部分：雄性Wistar大鼠分组给药同第二部分。6周后，麻醉处死大鼠，将胃大弯处胃黏膜组织固定，石蜡包埋切片。TUNNEL法检测胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡指数（PI）。 第五部分：雄性Wistar大鼠分组给药同第二部分。6周后，麻醉处死大鼠，迅速将胃大弯处胃黏膜组织-80℃冻存。Western blot法检测胃黏膜组织中NF-κB P65,p-NF-κB P65蛋白表达。 结果： 1、造模32周，两组大鼠体重相比较差异有统计学意义（p<0.05），其中模型组体重增长趋势缓慢。造模阶段两组体重增长值比较差异也有统计学意义（p<0.05）。光镜观察可见模型组胃黏膜不完整，萎缩，细胞形态不一致，表面可见脱落的上皮细胞，有的甚至有变性、坏死，腺体排列紊乱，部分细胞腺体有囊状扩张样的改变。细胞核染色加深，有的可见核分裂像，表明细胞出现不同程度的异型变化，部分还伴有肠上皮化生。 2、6周疗程结束后，一般情况消痰和胃组与维酶素组均好于模型对照组，其中消痰和胃组较为明显。消痰和胃组与正常对照组治疗过程中无死亡；模型对照组死亡3只（21.43％），维酶素组死亡1只（7.14%）；从第4周开始，消痰和胃组与维酶素组及模型对照组体重值比较差异均有统计学意义（p<0.05）；维酶素组与模型对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。各组异型增生数相比，消痰和胃组与模型组及维酶素组比较差异均有统计学意义（p<0.05），维酶素组与模型对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）。 3、免疫组化检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达：消痰和胃组、维酶素组、模型对照组之间两两比较差异具有统计学意义（p<0.05）。 4、TUNEL法检测细胞凋亡指数：模型对照组与正常对照组相比AI值比较差异有统计学意义(P<0.05);消痰和胃组和维酶素组、模型对照组相比较差异均有统计学意义(P<0.05)。 5、Western blot检测NF-κB P65,p- NF-κB P65蛋白表达：正常对照组与模型对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）,消痰和胃组与维酶素组、模型对照组之间两两比较差异有统计学意义（p<0.05）；而维酶素组与模型对照组相比差异没有统计学意义（p>0.05）。 结论： 1、胃癌前病变存在胃黏膜细胞的增殖与凋亡比例失调。 2、将导师胃癌痰证理论进一步完善，从胃癌前病变的角度认识胃癌防治的重要性，并且根据实验结果证实从痰论治胃癌前病变合理有效。 3、消痰和胃方能改善胃癌前病变大鼠相关症状，促进鼠毛再生，增加体重，逆转胃癌前病变胃黏膜细胞异性增生。 4、消痰和胃方可增加胃癌前病变大鼠胃黏膜细胞凋亡指数，促进胃癌前病变胃黏膜细胞凋亡。 5、消痰和胃方可降低胃癌前病变胃黏膜组织中Bcl-2蛋白的表达，提高Bax、Caspase-3蛋白的表达，促进胃癌前病变胃黏膜细胞的凋亡。 6、消痰和胃方能降低胃癌前病变胃黏膜组织中NF-κB通路相关蛋白NF-κB P65,p- NF-κB P65的表达，阻断NF-κB通路的异常激活。说明消痰和胃方逆转胃癌前病变，促进胃癌前病变胃黏膜细胞凋亡，可能是通过对NF-κB通路的影响而实现的。 7、从分子、细胞、整体不同层次为从痰论治胃癌前病变提供科学依据。