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目的： 1、观察苦豆碱对DSS诱导的结肠炎小鼠模型的疗效。 2、观察苦豆碱对DSS诱导的肠炎小鼠，对Th17/Treg相关细胞因子表达的调控作用。 3、采用体内及体外实验，从细胞学角度去探讨苦豆碱调控PI3K/AKT/mTOR通路的机制，并探求苦豆碱作用于小鼠结肠炎的靶标。 方法： 1. DSS法建立结肠炎小鼠模型及动物分组：将70只SPF级C57BL/6小鼠随机分为5组：①正常组（Control）；②苦豆碱组(Alo)；③治疗组(Alo-DSS)；④治疗组(DSS-Alo)；⑤造模组(DSS)。（1）每天记录小鼠的一般临床情况，观察腹泻及血便程度，记录小鼠体重变化、疾病活动指数(disease activity index， DAI)，实验结束后记录小鼠结肠长度、脾脏指数，取小鼠结肠组织制作病理切片并进行组织病理学评分。（2）取小鼠血清及结肠组织匀浆检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性。取小鼠结肠进行MPO的免疫组化。免疫印迹实验检测各组小鼠结肠MPO及NF-κB(nuclear factor-kappa B)蛋白的表达。 2. Real-Time PCR方法检测各组小鼠结肠组织中Th17细胞因子IL-17A， Treg细胞因子IL-10，TGF-β，Foxp3 mRNA表达水平。分离各组小鼠脾脏及肠系膜淋巴结，流式细胞仪技术检测Foxp3，CD44的表达。12只Foxp3GFP小鼠两组随机分为2组，正常对照组不做干预，治疗组注射苦豆碱20mg/天连续3天后牺牲小鼠，取新鲜脾脏，流式细胞仪技术比较GFP，CD62L的变化。 3.培养Jurkat细胞，加入不同浓度的苦豆碱干预（0.25mM，0.5mM，1mM）检测苦豆碱对PI3K/AKT/mTOR通路机相关蛋白水平的影响，并测定相关的上下游分子的蛋白表达水平。用共聚焦等实验从而进一步阐述该靶标蛋白经苦豆碱干预后，在Jurkat细胞中的变化。加入PI3K通路抑制剂以观察其对苦豆碱作用的影响。 4.研究不同浓度苦豆碱、LB-100对Jurkat细胞、小鼠脾脏单个核细胞、人脾脏单个核细胞的凋亡、增殖影响。 5.分选小鼠原代幼稚T细胞及Treg细胞，苦豆碱及LB-100干预，检测其对PI3K/AKT/mTOR通路机相关蛋白水平的影响 结果： 1.造模结束后，与正常组比较，DSS组体重下降明显、DAI评分显著升高、脾脏指数及病理评分均是最高的(P<0.001)。小鼠结肠组织病理学评分，3组比较有显著差异(F=180.2，P<0.001)，Alo-DSS组、DSS-Alo组与DSS组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。DSS组与另外2个治疗组比较：3组小鼠血清、结肠组织MPO活性比较均有显著性差异(P<0.001)。MPO，NF-κB的蛋白表达， Alo-DSS组、DSS-Alo组与DSS组分别比较（P<0.001）。MPO的 IOD值比较， Alo-DSS组、DSS-Alo组与DSS组分别比较，（P<0.001）。差异均有统计学意义。 2. RT-PCR结果，DSS组与Alo-DSS、DSS-Alo组分别比较，IL-17A，TGF-β， IL-10（P<0.001）。Foxp3表达比较没有差异(P>0.05)。5组C57BL/6小鼠脾脏及肠系膜淋巴结的Foxp3、CD44流式细胞计数比较，各组小鼠脾脏中Foxp3及CD44表达，组间比较均有显著性差异（P<0.001）。肠系膜淋巴结中Foxp3表达比较，5组间差异显著(P<0.001)。各组小鼠肠系膜淋巴结CD44表达，组间比较均有显著性差异（P<0.001）。Foxp3GFP小鼠腹腔注射20mg/kg的苦豆碱3天后，流式计数提示小鼠脾脏CD4+Foxp3+Treg细胞较对照组有显著增加（P<0.001）， CD62L升高（P<0.001）。 3.苦豆碱干预 Jurkat细胞，蛋白印迹实验发现苦豆碱能有效下调PI3K/AKT/mTOR信号通路；PP2Ab蛋白表达增加，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）； LB-100可以逆转苦豆碱的下调作用（P<0.001）。5组C57BL/6小鼠结肠蛋白印迹实验结果显示，经过苦豆碱治疗后，2组治疗组蛋白表达量与造模组DSS组比较，p-P85/p-Akt/p-mTOR均上升。PP2A的蛋白表达量升高，组间比较结果有差异（P<0.001）。小鼠幼稚T细胞及人脾脏单个核细胞，苦豆碱干预后，PI3K/AKT/mTOR下调，LB-100能逆转苦豆碱的功效（P<0.001）。 4.经过苦豆碱的干预，Jurkat细胞共聚焦结果提示，PP2Ab蛋白发生了膜转位。MLR提示，小鼠的供体T细胞的增殖活力苦豆碱抑制；LB-100能逆转1mM浓度的苦豆碱对T细胞抑制增殖功效（P<0.01）。Jurkat细胞经苦豆碱干预后，Bax蛋白表达上调，Bcl2,Cleave-caspase3蛋白表达下调(P<0.001)。Jurkat细胞、小鼠脾脏单个核细胞、人脾脏单个核细胞，CCK-8结果提示苦豆碱可促进细胞凋亡，而LB-100能够促进细胞增殖，增进细胞活力指数。小鼠Treg细胞的 Mcl-1蛋白表达上调，cleave-caspase3，Bcl2下调，提示苦豆碱促进提示苦豆碱促进Jurkat细胞、Treg凋亡（P<0.001）。 5.小鼠Treg细胞经过苦豆碱干预后，RT-PCR结果提示， Foxp3，TGF-β， IL-10，三者表达均上升。IL-17A下降，IL17A/Foxp3比例下降（P<0.001）。蛋白印迹实验提示，小鼠幼稚T细胞，苦豆碱干预组及LB-100处理组的Foxp3表达均升高（P<0.001）。小鼠Treg细胞的p-mTOR，p-Akt，而Foxp3（P<0.001）上升；LB-100促使PI3K/AKT/mTOR信号通路，发生上调（P<0.001）。 结论： 1.苦豆碱能够通过抑制体重降低、减少腹泻及粘液血便、降低DAI评分、减低脾脏指数、修复结肠粘膜损伤等，改善DSS诱导的小鼠肠炎临床症状。苦豆碱能减轻DSS诱导肠炎小的MPO活性、降低促炎因子NF-κB的表达等几个方面降低疾病的严重程度，减少炎症细胞浸润，对DSS诱导的结肠炎具有一定的改善作用。 2.苦豆碱可以抑制DSS诱导的结肠炎小鼠Th17细胞因子IL-17A的mRNA表达，流式细胞计数提示脾脏及肠系膜淋巴结Foxp3表达上升。这提示苦豆碱可能是通过对细胞因子调节作用，使失衡的Th17/Treg亚群恢复平衡，从而发挥抗炎和保护肠粘膜作用。苦豆碱可以促进小鼠脾脏及肠系膜淋巴结Treg的表达，CD44表达下降，CD62L表达升高，从而抑制T细胞过度活化，改善DSS诱导肠炎。 3.苦豆碱可以诱导下调PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进Treg的表达，可能的作用靶标为PP2A。苦豆碱能促进T细胞凋亡，抑制T细胞增殖， LB-100能逆转苦豆碱的这个功效。同时，苦豆碱和LB-100均能促进小鼠Treg表达，苦豆碱对DSS诱导小鼠肠炎的治疗关键可能是对Akt/PP2A活性影响。