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植酸酶(肌醇六磷酸酶)可以部分或者完全水解底物植酸上的磷酸基团。植酸(肌醇六磷酸)主要以植酸磷的形式储存在豆类、谷物和油料种子中。然而在单胃动物胃肠道中,植酸磷不能够被有效的水解吸收,额外添加植酸磷,不但造成了磷资源的浪费,而且动物粪便中未被吸收的磷排放到自然界破坏了微生物微环境,导致环境磷污染。此外,植酸作为抗营养剂,螯合了食物中的Ca2+、 Zn2+和Fe2+,使得动物不能吸收到这些金属元素。并且在酸性或者碱性环境下,植酸可以与蛋白质形成复合物从而影响了蛋白质的活性,溶解性或者降低了蛋白质抵抗蛋白酶能力。目前,植酸酶作为饲料添加剂已得到广泛认可和应用,为了适应大规模高效率的工业生产要求,就要进一步研究鉴定新型植酸酶,通过蛋白质工程改造和利用高效表达系统生产植酸酶。针对上述问题,一方面,本研究设计合成了大肠杆菌植酸酶基因 appA,利用生物信息学方法,分析设计突变位点,对其进行分子改造。通过多点突变和增强糖基化程度提高了植酸酶appA的热稳定性。另一方面,从大豆根部分离出两株能够产植酸酶的枯草芽孢杆菌,克隆了中性植酸酶基因phy(ycE),在大肠杆菌中进行表达,并对其酶学性质进行了系统研究。而且构建酵母表达重组载体转化毕赤酵母对中性植酸酶基因phy(ycE)在酵母中表达进行了初步探讨。本研究主要内容包括： ⑴大肠杆菌植酸酶appA的多位点突变、在毕赤酵母中的表达纯化及其性质研究。有文献报道利用大肠杆菌作为表达宿主研究植酸酶appA的酶学性质,鉴定出八个氨基酸改变可以提高其热稳定性及植酸酶在单胃动物胃肠道中的性能,本实验对植酸酶 appA进行定点突变引入这八个位点,得到植酸酶基因 appAM8,并且在酵母中进行表达,研究酵母表达系统表达植酸酶appAM8的酶学性质。通过硫酸铵沉淀、透析、阳离子柱交换和凝胶过滤层析,得到纯度达到95％以上的植酸酶。从最适温度、最适 pH、酶的热稳定性以及酶促反应动力学等方面对其性质进行了研究。结果表明,65℃处理30 min后,appA与appAM8残余活性分别为10%与40%。在37-70℃之间appAM8耐热性高于appA, appAM8比appATm值高13℃。通过CD光谱检测,结果也表明在热变性后appAM8二级结构有更好的恢复能力。appA与appAM8的Km值分别为0.36和0.48 mM,说明appAM8对底物有更高的亲和力。当胰蛋白酶与植酸酶量比值为1.5,37℃处理2 h, appAM8损失活性不到30%,表明appAM8对胰蛋白酶有更好的抵抗能力。 ⑵大肠杆菌植酸酶 appA的糖基化位点分析改造、在毕赤酵母中的表达纯化及其性质研究。大肠杆菌植酸酶 appA的序列分析表明,该蛋白存在三个糖基化位点。分别为:N139,N204,N317位点。此外,植酸酶appA自身有两个潜在的可以经过改造引入糖基化的位点,分别为:Q258,Q349。本研究通过定点突变引入了这两个潜在糖基化位点( Q258N, Q349N),将突变前后的植酸酶基因 appA和appA-Q258N/Q349N整合到毕赤酵母基因组上,并进行诱导表达。250 mL摇瓶诱导表达120 h,粗酶液中appA-Q258N/Q349N的酶含量达到0.3 mg mL-1,活性为1,030 U mL-1。经硫酸铵沉淀、透析、阳离子柱交换和凝胶过滤层析纯化后, appA-Q258N/Q349N比活性为3,137 U mg-1,分子量约为53 kDa。电泳检测结果表明,两个位点的突变增加了植酸酶appA的糖基化程度。热稳定性结果表明,在85℃处理10 min,与野生型植酸酶appA相比较,appA-Q258N/Q349N的热稳定性增强了40%。荧光光谱实验和差示扫描量热(DSC)分析结果表明,与植酸酶appA比较,appA-Q258N/Q349N的Tm值提高了4-5℃。appA-Q258N/Q349N的动力学参数Km值与Kcat分别为0.43 mM和3,058 s-1,与appA比较差异不大。 ⑶大豆根部两株产植酸酶菌的分离鉴定及中性植酸酶基因的克隆。从大豆根部土壤中筛选到两株产植酸酶的细菌菌株,对其进行形态学分析和16S rRNA鉴定,确定两个菌株均为枯草芽孢杆菌,并对其植酸酶的酶学性质进行了初步研究。通过PCR方法从该芽孢杆菌基因组中克隆了植酸酶基因phy(ycD)和phy(ycE),基因序列已提交GenBank(登录号为:EFS20452.1和JQ257502)。与NCBI已报道的植酸酶序列分别通过BLASTn和BLASTp程序进行比对,确定 phy(ycD)和phy(ycE)属于β-螺旋桨植酸酶家族。两个植酸酶核酸序列同源性达到98%。两个基因的开放阅读框(ORF)均为1149个核苷酸,编码382个氨基酸。N端26个氨基酸为信号肽序列,整个酶分子存在5个氨基酸差异,运用SWISS-MODEL服务器进行同源建模,使用Spdbv软件对其三维结构评估,这5个氨基酸中的4个分别处在酶分子不同二级结构部位。 ⑷β-螺旋桨植酸酶phy(ycE)在大肠杆菌中的重组表达和性质研究。将phy(ycE)基因在大肠杆菌中进行表达纯化以及性质研究。SDS-PAGE分析其分子量为45 kDa。表达纯化得到的蛋白比活性为14 U mg-1。最适pH为6.0,最适温度为50℃。钙离子可以显著提高其热稳定性。荧光光谱检测结果表明,与酶溶液中不含有钙离子的植酸酶相比较,植酸酶Tm值由47.8提高到了62.4℃。增加钙离子浓度稳定了植酸酶构象。通过CD检测,发现apo-酶和全酶在220-205 nm处光谱有明显差异。而钙离子激活酶与全酶在220-205 nm处相似,镧离子激活酶和apo-酶相似。铽离子敏化光谱结果表明,每分子植酸酶phy(ycE)结合5分子铽离子,酶分子上存在两个高亲和位点和三个低亲和位点。 ⑸β-螺旋桨植酸酶phy(ycE)在毕赤酵母中的表达。为了在酵母中高效表达植酸酶phy(ycE),本实验对中性植酸酶基因phy(ycE)进行了精氨酸密码子进行优化。利用优化信号肽 MF4I,构建了含优化基因与优化信号肽组合的重组质粒pPIC9-MF4I-phy(ycE)-5Arg。将野生型植酸酶phy(ycE)与α-分泌信号肽构建重组载体已转入毕赤酵母中且分泌表达。经 SDS-PAGE与酶活检测,表明分子量大小为45 kDa左右,有糖基化修饰,粗酶液中酶活性为0.85 U mL-1。通过对大肠杆菌植酸酶appA基因进行分子改造,筛选出两株性状优良的重组酵母工程菌。两个工程菌表达的植酸酶( appAM8和appA-Q258N/Q349N)均有良好的热稳定性,特别是引进糖基化位点后,重组蛋白的表达量没有受到大的影响,而热稳定性却有了明显的提高,具有良好应用前景。同时,本研究还从大豆根部分离出两株能够产植酸酶的枯草芽孢杆菌,获得了新的中性植酸酶基因phy(ycE)和phy(ycD)。在重组植酸酶phy(ycE)的酶学性质研究中,首次探讨了稀土离子镧和铽对中性植酸酶结构与功能的影响。对中性植酸酶的改造和利用提供了实验数据。