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目的:建立用斑点酶免疫渗滤法(Dot Immunoenzyme Filtration Assay,DIEFA)检测脑膜炎双球菌(A群)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、新型隐球菌抗原的诊断方法,为进一步研制检测急性脑(膜)炎病原体蛋白芯片试剂盒提供实验依据。方法:1建立用斑点酶免疫渗滤法检测已知的脑膜炎双球菌(A群)抗原:制备抗原,按二倍顺序稀释法将抗原、抗体及酶标抗体稀释成不同浓度;用方阵滴定法确定所有试验点及其相应的抗原抗体反应浓度;判读实验结果并用分析软件读取光密度值(OD值),统计学分析得出最佳反应组合及反应方程。2建立用斑点酶免疫渗滤法检测已知的单纯疱疹病毒抗原:用二倍顺序稀释法将抗原、抗体及酶标抗体稀释成不同浓度,用方阵滴定法确定所有试验点及其相应的抗原抗体反应浓度;判读实验结果并用分析软件读取光密度值(OD值),统计学分析得出最佳反应组合及反应方程。3建立用斑点酶免疫渗滤法检测已知的巨细胞病毒抗原:用二倍顺序稀释法将抗原、抗体及酶标抗体稀释成不同浓度,用方阵滴定法确定所有试验点及其相应的抗原抗体反应浓度;判读实验结果并用分析软件读取光密度值(OD值),统计学分析得出最佳反应组合及反应方程。4建立用斑点酶免疫渗滤法检测已知的新型隐球菌抗原:制备抗原,用二倍顺序稀释法将抗原、抗体及酶标抗体稀释成不同浓度,用方阵滴定法确定所有试验点及其相应的抗原抗体反应浓度;判读实验结果并用分析软件读取光密度值(OD值),统计学分析得出最佳反应组合及反应方程。结果:1斑点酶免疫渗滤法检测已知的脑膜炎双球菌抗原的最佳反应浓度:鼠抗(A)群脑膜炎双球菌多克隆抗体浓度0.1250μg/ml(1:800)与抗鼠/兔通用型酶标抗体浓度1:10。稀释抗原建立回归方程Y=0.4564X+0.0728,相关系数r=0.9212(P <0.05),抗原最小检出浓度33.7 ng/m(l1?3200);对照均为阴性,无非特异性反应。鼠抗(A)群脑膜炎双球菌单克隆抗体浓度0.3125μg/ml(1:320)与抗鼠/兔通用型酶标抗体浓度1:10为最佳反应浓度组合;稀释抗原建立回归方程Y=0.4828X+0.0689,相关系数r=0.9070(P<0.05),抗原最小检出浓度16.8 ng/ml(1?6400);对照均为阴性,无非特异性反应。2斑点酶免疫渗滤法检测已知的单纯疱疹病毒抗原的最佳反应滴度为:兔抗单纯疱疹病毒多克隆抗体浓度8.4μg/ml(1:100)与抗鼠/兔通用型酶标抗体浓度1:10。稀释抗原建立回归方程Y=0.0984X+0.1310,相关系数r=0.8884(P<0.05),抗原最小检出浓度66.8 ng/ml(1?2048);对照均为阴性,无非特异性反应。3斑点酶免疫渗滤法检测已知的巨细胞病毒抗原的最佳反应滴度为:兔抗巨细胞病毒多克隆抗体浓度12.5μg/ml(1:160)与抗鼠/兔通用型酶标抗体浓度1:10。稀释抗原建立回归方程Y=0.0440X+0.0576,相关系数r=0.9297(P<0.05),抗原最小检出浓度55.7 ng/ml(1?4096);对照均为阴性,无非特异性反应。4斑点酶免疫渗滤法检测已知的新型隐球菌抗原的最佳反应滴度为:鼠抗新型隐球菌单克隆抗体浓度2.5μg/ml(1:80)与抗鼠/兔通用型酶标抗体浓度1:10。建立不同稀释浓度的抗原与A值变化关系的标准曲线,求出回归方程Y=0.3528X+0.0693,相关系数r=0.8889(P<0.05),抗原最小检出浓度8.7 ng/ml(1:4096);对照均为阴性,无非特异性反应。结论:初步建立了用斑点酶免疫渗滤法检测脑膜炎双球菌(A群)、单纯疱疹病毒抗原、巨细胞病毒抗原、新型隐球菌抗原的实验方法。用已知鼠抗A群脑膜炎双球菌多克隆抗体、单克隆抗体检测脑膜炎双球菌抗原反应的抗原最小检出浓度分别为33.7 ng/ml和16.8 ng/ml;已知兔抗单纯疱疹病毒多克隆抗体检测单纯疱疹病毒,抗原最小检出浓度66.8 ng/ml;已知兔抗巨细胞病毒多克隆抗体检测巨细胞病毒,抗原最小检出浓度55.7 ng/ml;已知鼠抗新型隐球菌单克隆抗体检测新型隐球菌,抗原最小检出浓度8.7 ng/ml。该方法具有灵敏度高、特异性强,且快捷、简单、结果可保存等优点,适合在广大临床实验室推广应用。