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研究背景:疼痛是由于伤害性刺激或组织损伤引起的不愉快的感官体验。组织损伤导致炎症和炎性疼痛,如关节炎,颞下颌关节紊乱综合征和手术相关的疼痛。炎性症痛、术后疼痛典型的特征是出现热痛和机械痛觉过敏,对有害的热和机械刺激提高了响应,包括对正常无害机械刺激如轻触摸产生异常性疼痛。研究认为,炎性疼痛和术后疼痛以外周背根神经节和三叉神经节的初级传入神经元致敏、脊髓背角和皮质神经元的中枢感觉敏化以及神经元可塑性改变为特征。组织损伤后释放炎症介质,如缓激肽,前列腺素,H+,神经生长因子;促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α,白细胞介素-1β和白细胞介素-6和促炎趋化因子(如趋化因子CC基序配体,CCL2)引起外周敏化。外围终端伤害感受器均表达所有这些炎性介质的受体。这些受体的活化导致关键传导分子的过度活化,如多动瞬时受体电位亚型V1(TRPV1)和A1(TRPA1),钠通道Nav1.7,1.8和1.9。结果导致伤害性感受器通过蛋白激酶,如蛋白激酶A(PKA),蛋白激酶C(PKC)和丝裂原活化蛋白激酶(的MAPKs)的活化,敏感度和兴奋性显著增加。组织损伤触发脊髓伤害性感受器的亢进导致的释放的神经递质增加,如谷氨酸盐和神经调节因子增加(如P物质和脑源性神经营养因子),最终导致背角突触后神经元的极度活化(即中枢敏)。中枢致敏在持续性疼痛的维持和损伤部位以外的产生的次级疼痛中具有重要作用。磷酸化的细胞外信号调节激酶(pERK)是MAPK家族成员在背角神经元具有伤害性感受特异反应性并可作为中枢致敏的标记物。因此,p ERK的增加,可诱导中枢敏化,并在其的维护阶段具有至关重要的作用。最近的进展也指出的神经胶质细胞在炎性疼痛中具有重要作用。在炎性疼痛和术后疼痛的研究中表明,脊髓和大脑中的小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢致敏发生和发展中扮演了重要角色。组织损伤后,脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞产生TNF-α和IL-1β,通过增加脊髓背角兴奋性神经元活性和减少抑制抑制性神经元活性触发中枢敏化。肝X受体(LXRα和β)属于核受体超家族,它们是配体激活的转录因子。它们的配体是氧化胆固醇的代谢产物,它们参与调节脂质代谢基因。lxrs有2个亚型,lxrα主要表达在肝脏中,而lxrβ则全身多系统广泛表达,并在免疫系统和中枢神经系统(cns)具有关键作用。lxrα敲除小鼠不会造成基本发育缺陷,而lxrβ缺失小鼠则会引起大脑皮层脑回受损,将会导致放射状胶质细胞(rgc)发育失常,最终引起胚胎发育期间新生神经元的迁移障碍。研究证实,lxrβ敲除(ko)小鼠大脑皮层放射状胶质细胞转化为少突胶质细胞或星形细胞会出现异常。lxrβ与多巴胺能神经元的发育密切相关,lxrβ的缺失增加肌萎缩性侧索硬化症-帕金森氏痴呆的风险。lxrβ特异性的在脊髓灰质的神经元和白质星形胶质细胞、少突胶质细胞的亚群表达。lxrβ缺失雄性小鼠成年后出现运动神经元变性。研究证实,lxrβ激活后,对脊髓损伤可产生神经保护作用。这些最新的研究表明,lxrβ为cns的正常功能是必不可少的。lxrβ可以调节肾上腺类固醇生成来控制体内胆固醇平衡,从而保护糖尿病引起的周围神经损伤。lxrβ在关节软骨中大量表达,lxrβ基因敲除显著增加il-1β处理后小鼠关节软骨蛋白多糖(聚集蛋白聚糖)降解和前列腺素e2的产生,证实lxrβ对关节软骨具有保护作用。人类软骨移植研究中发现激活的lxrs合成配体gw3965显著降低细胞因子诱导的关节软骨退化和组织聚集蛋白聚糖的丢失。此外,小鼠口服gw3965可有力地缓解半月板撕裂骨关节炎模型中的关节疼痛。通过对lxr配体在调制lps诱导小鼠腹腔巨噬细胞mpges-1表达的研究中发现,lxr配体(22r-hc)和to901317降低lps诱导mpges-1mrna、mpges-1蛋白以及cox-2蛋白的表达;然而,lxr配体不影响微粒体前列腺素合成酶-2及细胞前列腺素合成酶的表达。因此,lxr配体可抑制巨噬细胞前列腺素2生成,通过抑制lps诱导巨噬细胞cox-2-mpges-1轴的激活,减轻关节炎症、缓解炎症性疼痛。目前的研究显示,lxrβ对疼痛调制的确切作用尚未阐明,lxrβ诱发的感觉过敏的分子机制是不确定的。对lxr调制痛觉过敏的细胞和分子机制的研究可为的临床治疗药物的开发提供新的策略。研究方法:1.观察lxrβ在与痛觉调制相关区域的表达,及其与疼痛在脊髓水平传导通路的关系。2.观察lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠痛行为行为学改变,明确lxrβ敲除小鼠痛行为的改变,及lxrβ对不同疼痛类型(热痛和机械痛)的影响。3.建立福尔马林痛模型,观察lxrβ对炎性疼痛的调控,进行痛行为评分,评价量效关系,并观察福尔马林疼痛模型中,lxrβ敲除小鼠对比野生型小鼠表型改变对外周炎症的影响,以及评价分析炎性疼痛刺激情况下lxrβ对脊髓痛觉调制通路上脊髓背角神经元和胶质细胞激活的状态的影响。4、westernblot定量分析对比6-7月龄野生型与lxrβ基因敲除小鼠脊髓perk的水平,探讨lxrβ对炎性疼痛的调控的机制。结果:1.lxrβ在野生型小鼠的足底炎症组织及脊髓l3-l5节段均有表达。2.哈格里夫斯实验中lxrβ敲除小鼠热缩足反射潜伏期(4.12±0.08秒)与野生型小鼠(6.26±0.13秒;p<0.01)相比热缩足潜伏期显著缩短。在热板实验中,与野生型小鼠热板致痛潜伏期(7.52±0.28秒;p<0.01)相比,lxrβ敲除小鼠(4.65±0.18秒)反应潜伏期显著下降。使用vonfrey纤维丝测定机械痛阈值,lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠在无害的机械刺激下,响应阈值没有差别。这些数据表明,lxrβ参与基础热痛阈调节,而对机械痛基础痛阈则无调节作用。3.福尔马林足底注射后检测了lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠足爪tnf-α,il-1β、il-6和nf-κb的水平,以及对注射足足爪肿胀程度进行检测评估。lxrβ缺失显著增加福尔马林诱导的足爪炎性因子tnf-α和il-1β的水平,但是il-6水平没有改变。lxrβ的缺失增加福尔马林诱导的足爪组织的nf-κb的表达。lxrβ缺失后出现以下福尔马林诱导的小鼠足底组织水肿程度与野生型小鼠相比,在第1小时和第2小时两个时间点均显著增加。这些结果表明,lxrβ缺失诱导的炎症疼痛超敏反应与nf-κb相关的促炎细胞因子的增加有关,且lxrβ缺失显著影响福尔马林诱导的外周组织炎症的程度。4.两组小鼠右后足爪底射福尔马林后,小鼠产生的典型的双相疼痛反应。lxrβ敲除小鼠平均疼痛评分与野生型小鼠相比的各相伤害性反应显着增加。第一阶段:wt,2.37±0.25;lxrβ敲除,3.28±0.09,p?<0.01;第2阶段:wt,9.78±1.59;lxrβ敲除,13.95±2.51,p<0.01)。分析了抬脚和舔舐时间,与野生型小鼠相比,lxrβ敲除小鼠显著增加。(第一阶段:wt,211.75±35.61秒;lxrβ敲除,372.75±20.41秒,p<0.01;第2阶段:wt,571.5±60.61秒;lxrβ敲除,1194.6±161.89秒,p<0.01)。这些数据表明,lxrβ缺失引起在福尔马林实验各个时相伤害性反应显著增强。5.注射福尔马林到小鼠的后足爪后,诱导脊髓注射一侧fos蛋白的大量表达。。在野生型小鼠的脊髓l3-l5节段内,大部分的fos标记的神经元在脊髓背角i-ii层大量表达,而的iii-v层fos蛋白标记的神经元的数目比在i-ii层显著降低。与野生型小鼠相比,lxrβ敲除小鼠注射福尔马林后,脊髓背角i-ii,iii和iv-v层的fos蛋白标记的神经元的数目分别增加43%,135%分别和85%。这一增长提示福尔马林注射后,足底注射诱导lxrβ敲除小鼠的脊髓背角更多伤害感受神经元激活。6.c-fos与cabps的免疫荧光双标染色结果中发现,lxrβ敲除小鼠与野生型小鼠相比,脊髓背角注射侧fos+/calbindin+和fos+/calretinin+双标阳性的神经元百分比显著增加。然而,脊髓背角fos+/parvalbumin+没有双标阳性的神经元。因此,研究结果表明lxrβ缺失引起小鼠足底注射福尔马林后2小时,诱导脊髓背角浅层兴奋性神经元的激活。7.ib4与sp或cgrp的免疫荧光双标共定位结果发现,lxrβ敲除小鼠与野生型小鼠相比,小鼠接受注射福尔马林足底注射后,脊髓l3-l5腰椎节段注射侧背角浅层ib4,cgrp和sp的免疫阳性产物光密度值分别增加37%,47%,和47%。而脊髓l3-l5腰椎节段对照侧背角浅层ib4,cgrp,或sp免疫阳性产物光密度值没有显著差异。因此,lxrβ缺乏可促进福尔马林诱导的急性痛和炎症痛初级伤害性传入活化。8.lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马林2小时后,脊髓背角浅层perk免疫学阳性细胞与neun标记的神经元进行共定位后发现,perk+阳性细胞与neun+阳性细胞有共标,但不与gfap标记的星形胶质细胞或iba1标记的小胶质细胞有共标。同时westernblot检测了脊髓l3-l5节段perk的水平,结果显示,lxrβ敲除小鼠脊髓perk的水平较野生型小鼠显著增高。结果表明lxrβ的缺失可导致福尔马林诱导小鼠脊髓背角神经元perk表达升高。9.lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马后2小时后,脊髓背角注射侧和对照侧均出现明显的星形胶质细胞活化状态。与野生型小鼠相比,lxrβ敲除小鼠注射福尔马林后2小时注射侧脊髓背角浅层i-v层gfap阳性细胞的数量显著增加(野生型小鼠:131.4±9.83细胞个数/每张切片;lxrβ敲除小鼠,169.5±7.91细胞个数/每张切片;*p?<0.05)。lxrβ敲除小鼠对照侧脊髓背角gfap阳性细胞的数目与野生型小鼠的相比,显著增高(野生型小鼠,106±1.5细胞个数/每张切片;lxrβ敲除小鼠,126.2±5.5细胞个数/每张切片;*p?<0.05)。lxrβ敲除小鼠和野生型小鼠足底注射福尔马后2小时后,iba1标记的免疫阳性细胞注射侧数量显著多于对照侧,且主要集中于背角浅层Ⅰ-ii层。与野生型小鼠相比,髓背角iba1阳性细胞在同侧和对侧腰脊的数量在lxrβ敲除小鼠显著增加(注射侧,wt,111.8±3.5细胞个数/每张切片;lxrβ敲除,162.3±9.3细胞个数/每张切片;p<0.01;对照侧,WT,84.1±4.0细胞个数/每张切片;LXRβ敲除,106.1±3.5细胞个数/每张切片;p?<0.01)。结果表明,福尔马林注射后,LXRβ缺乏激活小鼠的背角星形细胞和小胶质细胞,从而促进炎性疼痛的发生发展。结论:1.LXRβ在痛觉初级传入终端及脊髓均有表达并发挥重要作用。2.LXRβ缺乏小鼠对有害热刺激和炎症性疼痛比野生型小鼠更敏感。3.福尔马林实验中,LXRβ敲除小鼠在两个阶段均增强疼痛反应。这表明,LXRβ是外周和脊髓水平调制损伤诱导的痛觉过敏以及急性伤害性的关键因素之一。4.LXRβ通过NF-κB途径调节促炎性趋化因子如TNF-α和IL-1β的合成或释放介导对福尔马林的炎症反应。5.LXRβ调节小鼠脊髓背角浅层兴奋性神经元活性,抑制伤害性刺激引起的痛觉传入,进一步调节炎性疼痛。6.LXRβ抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,调节突触传递和神经元兴奋性,抑制中枢敏化和炎性疼痛发生和维持。