论文部分内容阅读
猫泛白细胞减少症病毒（Feline panleukopenia virus,FPV）,又名猫细小病毒,是猫科动物的一种致死性病原,宿主范围广泛。除感染猫科动物外还会引起鼬科以及浣熊科动物等感染,但不能有效的感染家犬。2018年以来,巴基斯坦、泰国、越南、中国等国学者相继报道从腹泻犬粪便中检测出FPV的VP2序列,可能是一种新的跨种间传播到犬的FPV,但未获得病毒的基因组信息,无法总结其分子特征,且未分离到毒株进行犬的感染实验,不能排除机械性带毒的可能性。本研究的目的是调查川渝部分地区腹泻犬中新型FPV的流行情况,分析该病毒的基因组特征,证实其跨种间传播的能力,取得如下成果:1、犬源细小病毒的流行率为了解川渝部分地区犬源细小病毒在腹泻犬中的流行率,于2019年4月-2021年6月分别在重庆、西昌、成都多个宠物医院采集了192份犬腹泻样本,使用文献报道的靶向VP2检测引物对样本进行PCR检测,筛选出犬源细小病毒的阳性样本,扩增的目的片段为VP2基因第3590-4157 nt,产物长度为567 bp,包含VP2蛋白上297、300、323、426共4个关键氨基酸位点,可用于CPV-2分型以及区别CPV-2与FPV。结果显示:犬源细小病毒的阳性率为58.9%,其中CPV-2、CPV-2a、CPV-2c、New CPV-2a、New CPV-2b占比分别为2.7%、12.4%、35.4%、23.9%、0.9%;值得注意的是,有24.8%阳性样本经序列分析证实为FPV,这些毒株不仅在VP2蛋白上含有FPV的关键氨基酸位点（300A、297A、323D、426N）,并且在进化树上也与FPV聚为一支,明显区别于CPV-2及其变异体。本研究结果表明:（1）川渝部分地区CPV-2的流行表现为多种变异株同时流行,并且CPV-2c已成为优势流行毒株;（2）一种可能的新型FPV在川渝部分地区犬中流行。鉴于世界多地已经出现了新型FPV,均未分离病毒进行犬的感染实验,不能排除机械性带毒的可能性,因此,有必要进一步分离该病毒以探究对犬的感染性。2、犬源FPV毒株的分离鉴定及部分生物学特性将检测为犬源FPV阳性的样本处理后接种于F81细胞系中,进行病毒分离,最终成功获得6株稳定病变的犬源FPV分离毒株,经PCR、间接免疫荧光、电镜进一步证实为FPV,分别命名为（C-88、C-1、C-9、C-4、D-13、C-F9）。测得纯化后的分离毒株C-9 TCID50为10-4.8TCID50/0.1m L,该毒株在4℃条件下,p H6-8之间均能凝集猪红细胞,但在37℃时失去血凝性;同步接种于MDCK细胞后,不仅能进行有效的增殖,还能引起明显的细胞病变;明显区别于经典FPV。使用6m L 10-4.8TCID50/0.1m L的分离毒株C-9的病毒液,经口服人工感染3只幼犬后,幼犬通过粪便持续排毒9d,其中有1只犬出现轻微腹泻的症状;感染幼犬的心脏、胸腺、淋巴结均有犬源FPV的检出,血凝抑制实验测得血清抗体效价上升到2~7,并从心脏及粪便中成功重新分离出攻毒毒株C-9。结果表明:本研究首次从犬腹泻样本中分离到一种FPV,该病毒经口服途径能引起幼犬全身感染,并持续排毒。首次证明该犬源FPV具有跨种间传播感染犬的能力。3、犬源FPV的基因组分析为了解犬源FPV的基因组特征,对分离毒株基因组进行扩增、测序。成功获得6条犬源FPV基因组序列,全长共4269 bp,包含两个开放阅读框,一个在3’端编码NS1及NS2蛋白,另一个在5’端编码VP1及VP2蛋白（Gen Bank登录号:MZ913314～MZ913319）。选取Gen Bank中CPV与FPV共376个基因组序列（其中49条属于FPV、327条属于CPV-2及其变异株）,450个完整NS1基因序列（其中111条属于FPV、339条属于CPV-2及其变异株）和2822个完整VP2基因序列（其中136条属于FPV、2686条属于CPV-2及其变异株）,分别与本研究获得的6条分离毒株序列建立进化树进行遗传进化及基因组特征分析。结果显示:本研究成功获得的6条的犬源FPV基因组,在全基因进化树上与FPV聚为一大支,且明显区别与CPV-2及其变异株;在VP2蛋白上,犬源FPV具有FPV所有的关键氨基酸位点（80K、93K、103V、232V、323D、564N、568A）,且未发现其他独特的氨基酸突变;VP1蛋白上无氨基酸位点突变,但在其内含子序列上均具有2个核苷酸位点突变（a2333g、g2369a）;与经典FPV NS1蛋白序列相比,犬源FPV具有4个相同的氨基酸位点突变（V115I、V132L、H247Q、H595Q）。因此,这种跨种间传播感染犬的FPV是一种NS1突变株,代表了一种新的具有跨种间传播的毒株,为进一步研究FPV的遗传进化和跨物种传播提供了参考。