【摘 要】
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目的:探讨巨噬细胞刺激蛋白/酪氨酸激酶受体RON(MSP/RON)信号通路在LPS诱导的树突状细胞成熟过程中的作用以及可能的分子机制。方法:体外培养C57/B6小鼠骨髓诱导的树突状细胞
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目的:探讨巨噬细胞刺激蛋白/酪氨酸激酶受体RON(MSP/RON)信号通路在LPS诱导的树突状细胞成熟过程中的作用以及可能的分子机制。方法:体外培养C57/B6小鼠骨髓诱导的树突状细胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs),使用RT-PCR、流式细胞术以及Western blot检测酪氨酸激酶受体RON在成熟BMDCs与未成熟BMDCs中的表达。使用RON激动剂巨噬细胞刺激蛋白(Macrophage stimulating protein,MSP)或抑制剂BMS777607改变LPS诱导树突状细胞成熟中RON的活性,检测下游通路Erk1/2与Akt的活化。用MSP或BMS777607抑制或者激活BMDCs上的RON后使用LPS分别刺激BMDCs 6h、12h、24 h,流式细胞术检测CD86、MHC II表达差异,同时使用RT-PCR检测MHC II的反式转录因子CIITA和CD86的m RNA转录情况。使用RT-PCR检测各组March-I与March-8基因表达,使用免疫沉淀检测CD86分子与MHC II分子的泛素化水平。Elisa检测各刺激组与对照组上清中IL-1β与IL-12p70含量。将Balb/c小鼠脾细胞进行磁珠分选得到纯化CD3~+T细胞与刺激后的BMDCs混合,根据混合淋巴细胞反应方案进行共培养,使用流式细胞术检测T细胞增殖情况。结果:1.酪氨酸激酶受体RON在BMDCs上表达,RON的表达程度并未受到LPS(100ng/ml)刺激后发生改变。2.RON在BMDCs上的激活仍能活化下游通路Akt与Erk1/2。3.RON受体的抑制使BMDCs受LPS刺激成熟时的CD86与MHC II表达明显下降,但CD86的m RNA并未改变,MHC II的反式转录因子CIITA转录升高。4.RON的抑制导致E3连接酶March-1表达升高,E3连接酶March-8表达未改变。免疫沉淀实验显示RON的抑制导致CD86与MHC II泛素化程度加剧。5.RON的抑制导致成熟BMDCs释放IL-1β与IL-12p70能力减弱。6.混合淋巴细胞反应显示RON抑制后成熟的DC刺激T淋巴细胞增殖能力下降。结论:酪氨酸激酶受体RON通过E3连接酶March-1保护LPS诱导的树突状细胞成熟。
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