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研究背景与目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis)是缺血性脑卒中的重要病因,但是近年的研究显示颅内、外动脉粥样硬化(intra- and extracranial atherosclerosis)可能具有不同的危险因素和发病机制。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)是血管中膜的主要细胞成分,当血管损伤后,VSMCs可发生表型转化(phenotypic modulation),即从静息态的收缩表型(contractile phenotype)转变为增生态的合成表型(synthetic phenotype),重新获得向内膜迁移并增殖的能力。VSMCs的表型转化引发的细胞增殖、迁移、黏附等细胞功能的变化是动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病共同的病理学特征。因此,VSMCs的体外培养技术为研究其生物学行为以及相关疾病的发病机制及防治策略提供了一条重要途径。目前颅外动脉VSMCs的培养已经得到广泛应用,但有关颅内脑动脉VSMCs培养的报道少见,且多取材于牛、猪、犬、兔等动物较粗大的脑血管。以往报道的酶解离法培养VSMCs因操作繁琐,而限制了其应用。本研究旨在对原有的酶消化法进行改良,建立大鼠颅内、外脑动脉VSMCs的体外培养方法,为颅内、外动脉粥样硬化等脑血管疾病机制及治疗的研究提供一个良好的体外实验模型。方法:1、VSMCs的原代培养:(1)大鼠脑基底动脉VSMCs:取2只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重250~300 g) ,断颈处死后以75%酒精全身湿润消毒。无菌条件下分离大鼠脑基底动脉,去除血管外膜后剪成约0.2 mm的小段, 37℃分别用0.1%Ⅰ型胶原酶消化5 h,0.125%胰蛋白酶消化10 min。将消化后得到的细胞用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。(2)大鼠颈动脉VSMCs:1只SD大鼠取仰卧位固定,于颈部正中切一2 cm长切口。无菌条件下暴露左侧颈总动脉,切取长约1.5 cm的血管段。将其去除血管外膜及内膜后剪成约0.2 mm的小段,然后按照前述方法行酶消化和培养。2、VSMCs的传代培养:当细胞生长达80% ~90%汇合时,采用0.25%胰蛋白酶消化和传代培养。3、细胞纯化:采用人工刮除法及差速贴壁法纯化细胞。4、VSMCs鉴定:平滑肌细胞通过观察其形态学及生长方式来鉴定。α-平滑肌肌动蛋白是分化型VSMCs的特异性标志物,因此同时采用α-平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定。一抗为小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体(1:300),二抗为生物素化山羊抗小鼠IgG,然后采用SABC试剂盒说明行免疫组化染色。5、细胞存活率测定:取第5代细胞,采用血球计数器和台盼蓝排斥实验来计算细胞存活率。结果:原代培养3 d后,来自大鼠基底动脉或颈总动脉的细胞开始贴壁,2周后细胞呈梭形,汇合后具有平滑肌细胞典型的“峰-谷”样生长特点。传代培养的细胞保持上述特征,第5代细胞经α-平滑肌肌动蛋白表达鉴定,基底动脉VSMCs和颈总动脉VSMCs的纯度分别达97%和98%以上。台盼蓝排斥实验检测大鼠基底动脉VSMCs或颈总动脉VSMCs存活率达95%或96%以上。结论:这种方法操作简单、结果可靠、成本低廉,可为颅内、外动脉粥样硬化、再狭窄等脑血管疾病机制和治疗的研究提供适宜的体外培养细胞模型。