论文部分内容阅读
姬松茸（Agaricus blazei Murill，ABM）是近年来新兴的一种食药兼用菌，因其富含多种活性成份，可作为免疫调节剂、抗癌剂、抗突变剂和抗菌物质的来源，因而引起全世界的极大关注。由于姬松茸具有多种生物活性，具有广泛的应用价值和前景，因而对其活性成分的提取分离就显得尤为重要。对于姬松茸多糖的提取分离纯化过程国内外有很多报道，技术比较成熟，但是以姬松茸多糖为主原料的保健食品或抗癌药物目前还少有报道。本论文以姬松茸粗多糖为原料，开发姬松茸多糖注射液，为其作为一种新型的抗癌辅助药物走向市场奠定实验依据。为保证姬松茸多糖注射液的安全性，根据《中华人民共和国药典》及《中药、天然药物提取纯化工艺的相关规定》，选取了经济、安全、高效的分离、纯化、浓缩和干燥方法。首先Sevage法除蛋白，根据文献，确定氯仿：正丁醇为3：1，多糖浓度2mg·mL-1时，重复三次，除蛋白效果最佳；脱色采用了双氧水氧化法，为加快脱色时间，又要避免双氧水对多糖结构的破坏，实验在37℃下进行；透析、浓缩、干燥过程同样为了保证多糖结构的完整性和提取后物质疏松易溶解，先透析，然后60℃浓缩，最后是冷冻干燥。此时得到的多糖半纯品（AB）呈褐色，粉末状，经苯酚硫酸法和考马斯亮蓝G250法测得总糖含量和蛋白质含量分别为85.4％和14.2％。多糖半纯品通过DEAE-纤维素离子交换层析进行初步分级纯化，用0、0.1、0.3mol·L-1的NaCl洗脱，得到三个组分，分别是AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ，其中AB-Ⅰ为中性多糖，AB-Ⅱ和AB-Ⅲ为酸性多糖。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ和AB-Ⅲ分别再通过Sepharose CL-4B凝胶层析进一步分级，AB-Ⅰ得到单一对称峰，透析干燥后为淡黄色粉末，AB-Ⅱ和AB-Ⅲ在主峰之前分别有一小峰，收集主峰，得到AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b，透析干燥后分别呈黄色和褐色粉末。AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b经纯度鉴定后，表明为均一的多糖，总糖含量为91.8％、90.4％和89.2％，蛋白质含量为7.1％、8.8％和9.3％。为了进一步探讨分离纯化的多糖半纯品AB及其组分AB-Ⅰ、AB-Ⅱ-b和AB-Ⅲ-b的免疫药理作用，我们使用环磷酰胺建立了小鼠免疫低下模型，并对多糖处理前后小鼠的免疫功能变化情况进行了检测，如免疫器官重量试验、外周血血象测定、腹腔巨噬细胞吞噬试验、溶血素生成试验、E玫瑰花环形成试验、淋巴细胞转化试验，从非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫方面全面检测它们的免疫药理作用。结果表明环磷酰胺致小鼠免疫低下模型建立成功，四个多糖均能弱化环磷酰胺对机体的毒副作用，并且有的指标能达到空白对照组水平，正常小鼠经四个多糖免疫后，与空白对照组相比除淋巴细胞转化试验外，均为差异极显著（P＜0.01）；在淋巴细胞转化试验中，AB-Ⅲ-b与空白对照组、AB和AB-Ⅰ组比较差异显著（P＜0.05），AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b组与空白对照组比较差异不显著（P＞0.05）。AB-Ⅲ-b在免疫器官重量试验和溶血素生成试验中，同AB、AB-Ⅰ和AB-Ⅱ-b组比较也是差异极显著（P＜0.01），说明AB-Ⅲ-b具有较好的提高机体免疫力的作用。在上述研究的基础上对姬松茸多糖注射液的生产工艺进行了设计，初步制得注射液成品，根据《中华人民共和国药典》和《中药、天然药物相关的技术指导原则》对注射液的中间体进行质量安全性试验：急性毒性试验、肌肉局部刺激试验、过敏试验和溶血试验，试验结果均符合相关规定，表明姬松茸多糖注射液可以用于肌肉注射和静脉注射，无毒副作用，不会产生不良后果。综上所述，姬松茸多糖是一种良好的免疫增强剂，可以弱化环磷酰胺对机体的毒副作用，初步制得注射液后，肌肉和静脉注射对机体无不良效果，如果应用于临床可与常规化疗药物配伍使用，加大疗效，保护正常细胞免受药物损伤，因此可以开发作为新型抗癌辅助药物，造福人类。