论文部分内容阅读
纤维素是细胞壁最主要的组分，对植物的生长发育至关重要。尽管大量的研究证明纤维素是由位于质膜上的纤维素合酶复合体(Cellulose Synthase Complex，CSC)催化合成，但人们对于纤维素合成机理仍知之甚少，对于合成信号及其信号转导通路的认知更是空白。OsCESA4，7，9是参与次生壁纤维素合成的关键基因，其中任何一个成员突变将导致水稻脆秆(Brittle Culm，bc)表型。因此bc突变体是用于揭示纤维素合成机理的理想研究材料。 本文首先对一个脆秆突变体bc13-2进行了功能研究。该突变体机械支撑力下降，次生壁变薄，纤维素含量显著减少。图位克隆发现bc13-2源于纤维素合酶OsCESA9末端20个碱基的缺失，导致OsCESA9末端氨基酸Asn-Cys突变为Ser-Asp-Phe，是一个未报道过的CESA新的突变形式。而将含OsCESA9的全长DNA(pBC13F)转入突变体可互补bc13-2突变体表型，说明定位基因的正确性。生物信息学分析发现，拟南芥和水稻中CESAs羧基端的半胱氨酸极其保守，但该位点的作用机制仍不清楚。考虑到CESAs羧基端可能对蛋白-蛋白互作、即CSC复合体的形成极其重要，将突变的OsCESA9蛋白与其他次生壁CESAs蛋白进行互作研究，发现末端两个氨基酸、尤其是半胱氨酸的突变可导致互作丧失，进而影响CSC复合体形成及纤维素合成缺陷。该突变体对揭示CESAs蛋白的作用方式有重要的意义。 对于次生壁纤维素合成上游信号的研究仍比较缺乏，植物激素、光照、机械力、过氧化氢(H2O2)等均可能被归于其中。而近年来一氧化氮是被广泛关注的重要植物信号，对于它是否参与调控细胞壁合成还未知。将野生型水稻用不同浓度的硝普钠(SNP∶ NO的供体)处理，发现CESAs在转录和蛋白水平上变化不显著，但纤维素含量发生显著变化，即低浓度SNP可促进纤维素合成而高浓度则抑制，表明NO可调控纤维素合成，而这种调控可能是通过对CESAs蛋白的翻译后修饰实现的。由于半胱氨酸是NO进行S-亚硝基化修饰的靶位点，而CESAs羧基端保守的半胱氨酸极有可能是其中的靶标之一，因此bc13-2突变体是研究CESAs能否被S-亚硝基化修饰的理想材料。制备了包含此位点的重组蛋白，通过体外生化实验发现该位点是S-亚硝基化位点，还需体内的实验证据支持，这对深入解析纤维素合酶末端半胱氨酸的作用机理至关重要。 连接次生壁纤维素合成信号与CESAs的应该是受体类激酶。通过分析与次生壁CESAs共表达的基因，发现四个受体类激酶基因(OsK1-4)。利用反向遗传学、分子生物学、生物化学等研究手段，对这些受体类激酶开展了详细的功能研究。创建并获得这些候选基因的遗传材料，通过表型分析，确定OsK2和OsK4是位于纤维素合成的信号转导通路中的受体类激酶。OsK2的过量表达转基因材料纤维素含量显著下降，而RNAi干扰材料纤维素含量上升;与此同时，OsK2的突变体材料中纤维素含量明显上升。而OsK4的过量表达转基因材料中纤维素含量升高，而RNAi干扰材料纤维素含量下降;OsK4的突变体材料纤维素含量明显下降。说明OsK2和OsK4均参与次生壁纤维素的合成，所介导的信号转导通路具有相反的调控作用。 为了揭示OsK2和OsK4调控纤维素合成的信号转导通路，对这两个蛋白开展了生化及分子生物学研究。OsK2和OsK4都属于RLCK(Receptor-LikeCytoplasmic Kinase)基因家族，定位于细胞膜和细胞质中。基因的表达分析发现，在发育的茎秆中，OsK2和OsK4随着细胞壁加厚的起始表达量逐渐升高，并且在茎秆成熟之后仍维持较高的表达水平。生化分析表明，它们均具有对通用底物的激酶活性和自磷酸化活性。通过蛋白-蛋白互作挖掘到与它们互作的多个蛋白(Kinase interacting protein)，其中KIP1和KIP2是OsK2和OsK4的互作蛋白。体外激酶实验证实KIP1是OsK2的底物。KIP1即SWAF5是一个调控次生壁纤维素合成的NAC类转录因子。KIP1蛋白磷酸化质谱分析发现了一个被激酶OsK2磷酸化修饰的位点，而模拟磷酸化及去磷酸化突变的KIP1不影响其在细胞核内的定位。目前正在开展KIP1的磷酸化效应研究，以解析水稻次生壁纤维素合成的信号转导通路。 为将OsK2与上游信号相关联，利用SNP和H2O2处理了野生型和osk2-1突变体，发现OsK2响应SNP处理，并具有浓度依赖性。osk2-1突变体材料表现出对SNP敏感，暗示NO和H2O2可能是其上游信号分子。另一方面，水稻茎秆在机械力处理后，OsK4和CESAs基因表达量显著升高，纤维素含量明显提高，暗示机械力也可能是激酶所介导信号转导途径的上游信号。但这些信号的具体机制仍有待被进一步证实。