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研究背景:迁移侵袭抑制蛋白(Migration Invasion Inhibitory Protein, MIIP)作为一种新发现的肿瘤抑制基因,在多种肿瘤中低表达并参与多种肿瘤发病机制,但其在肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)中的作用尚不清楚.在本研究中,我们试图探讨MIIP在肾细胞癌中的表达和潜在作用机制.
研究方法:采用Westernblot和免疫组织化学染色检测MIIP在人RCC组织中的表达并分析其与临床病理分期、分级的相关性.进一步通过在MIIP稳定过表达、MIIIP稳定敲低的肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)细胞和正常肾近曲小管上皮细胞HK-2中行CCK-8实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析、划痕实验、Transwell实验及脐静脉内皮细胞管腔形成实验来评估MIIP对ccRCC增殖、迁移、侵袭和血管生成的影响.随后,在ccRCC细胞系中进行RNA-Seq测序、realtime-PCR、Westernblot、ELISA、细胞转染、共免疫沉淀、蛋白泛素化及乙酰化检测等实验探索MIIP抑制ccRCC恶性生物学行为的潜在作用机制.最后,在荷瘤裸鼠体内进一步对体外实验进行验证.使用student-t检验或χ2检验进行统计学分析.
研究结果:通过对临床样本分析发现,MIIP在大多数RCC组织样本中表达显著降低,且其表达水平与RCC的组织病理学分级及转移呈负相关.随后分别从体内及体外实验证明了MIIP抑制ccRCC细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成.通过RNA-Seq测序发现,在MIIP过表达后CYR61显著下调.qRT-PCR和Westernbloting进一步验证了MIIP对CYR61表达的抑制作用,且Rescue实验显示,CYR61的恢复能逆转MIIP对ccRCC细胞恶性生物学行为的抑制.此外,进一步的分子机制研究表明,MIIP能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6,HDAC6)的活性和表达促进热休克蛋白90(Heat shock protein90,HSP90)的乙酰化,影响其对HIF-2α的分子伴侣功能,从而使其竞争分子活化蛋白C激酶受体(Receptor of activated protein C kinase,RACK1)与HIF-2α结合增加并介导其泛素化和蛋白酶体降解,进而抑制其靶基因CYR61的转录翻译.
研究结论:1、MIIP在RCC中表达下调,且与肿瘤的组织学分级和远处转移呈负相关.2、MIIP抑制体外和体内ccRCC的增殖、迁移、侵袭和血管生成.3、MIIP促进HIF-2α的降解,并下调CYR61的表达.4、MIIP促进HSP90乙酰化,从而有利于竞争性分子RACK1与HIF-2α的结合和降解.5、MIIP通过负调节HIF-2α-CYR61轴的作用在RCC中扮演肿瘤抑制因子角色,是ccRCC的新型肿瘤抑制因子,也是ccRCC治疗的潜在靶标.
研究方法:采用Westernblot和免疫组织化学染色检测MIIP在人RCC组织中的表达并分析其与临床病理分期、分级的相关性.进一步通过在MIIP稳定过表达、MIIIP稳定敲低的肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)细胞和正常肾近曲小管上皮细胞HK-2中行CCK-8实验、平板克隆形成实验、细胞周期分析、划痕实验、Transwell实验及脐静脉内皮细胞管腔形成实验来评估MIIP对ccRCC增殖、迁移、侵袭和血管生成的影响.随后,在ccRCC细胞系中进行RNA-Seq测序、realtime-PCR、Westernblot、ELISA、细胞转染、共免疫沉淀、蛋白泛素化及乙酰化检测等实验探索MIIP抑制ccRCC恶性生物学行为的潜在作用机制.最后,在荷瘤裸鼠体内进一步对体外实验进行验证.使用student-t检验或χ2检验进行统计学分析.
研究结果:通过对临床样本分析发现,MIIP在大多数RCC组织样本中表达显著降低,且其表达水平与RCC的组织病理学分级及转移呈负相关.随后分别从体内及体外实验证明了MIIP抑制ccRCC细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成.通过RNA-Seq测序发现,在MIIP过表达后CYR61显著下调.qRT-PCR和Westernbloting进一步验证了MIIP对CYR61表达的抑制作用,且Rescue实验显示,CYR61的恢复能逆转MIIP对ccRCC细胞恶性生物学行为的抑制.此外,进一步的分子机制研究表明,MIIP能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6,HDAC6)的活性和表达促进热休克蛋白90(Heat shock protein90,HSP90)的乙酰化,影响其对HIF-2α的分子伴侣功能,从而使其竞争分子活化蛋白C激酶受体(Receptor of activated protein C kinase,RACK1)与HIF-2α结合增加并介导其泛素化和蛋白酶体降解,进而抑制其靶基因CYR61的转录翻译.
研究结论:1、MIIP在RCC中表达下调,且与肿瘤的组织学分级和远处转移呈负相关.2、MIIP抑制体外和体内ccRCC的增殖、迁移、侵袭和血管生成.3、MIIP促进HIF-2α的降解,并下调CYR61的表达.4、MIIP促进HSP90乙酰化,从而有利于竞争性分子RACK1与HIF-2α的结合和降解.5、MIIP通过负调节HIF-2α-CYR61轴的作用在RCC中扮演肿瘤抑制因子角色,是ccRCC的新型肿瘤抑制因子,也是ccRCC治疗的潜在靶标.