论文部分内容阅读
糖尿病（DM）是一种由于胰岛素缺乏或胰岛素功能缺陷所致慢性疾病，其伴随着一系列代谢紊乱。DM的患病率在全球不断增加。据国际糖尿病联合会（IDF）的最新统计数据，截止到2013年，全球有3.82亿人患有糖尿病，预计到2035年，这一数字将上升至5.92亿。2型糖尿病（T2DM）是糖尿病中最常见的形式，大约占全世界糖尿病的90％左右，其特点是高血糖症，血脂异常，以及代谢靶组织的胰岛素抵抗。2型糖尿病可导致严重的并发症，包括肾功能衰竭，失明，缓慢的伤口愈合和心血管疾病等。蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），调节细胞内诸多依赖酪氨酸磷酸化的关键生理过程，在代谢中起重要作用。已在许多人类疾病中都发现了PTP活性的失常。PTP1B是从人胎盘中第一个被成功分离和表征的PTP超家族成员，其分子量大约为50kDa（435个氨基酸），它包含一个高度保守的催化基序，其中的Cys215和Arg221是对其磷酸酶催化活性至关重要的。PTP1B是胰岛素信号转导通路中关键的负调节蛋白，其作用通过阻断胰岛素刺激的胰岛素受体（IR）的酪氨酸磷酸化，进而影响胰岛素受体（IRS-1）的磷酸化和其下游通路。通常情况下，胰岛素触发一系列磷酸化事件的级联放大，开始于IR上多个酪氨酸残基的自磷酸化，提高了IR的激酶活性，并导致其招募IRS-1而使之活化，接着激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（PKB，也称为AKT），最后激活葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）与细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）。激活GLUT4可以转运到细胞膜，从而影响葡萄糖的摄取；磷酸化的ERK1/2可以进入细胞核，影响基因的表达和翻译。PTP1B过表达或其酶活性的增加被发现存在于胰岛素抵抗和肥胖患者中。PTP1B基因敲除的小鼠是健康的，表现出胰岛素敏感性的提高，而且在高脂饮食的诱导下小鼠不发展为2型糖尿病和肥胖症。相当大的兴趣在增长以PTP1B作为治疗糖尿病和肥胖症的靶点。厚朴是中国传统医药，多年来被用于治疗各种疾病，包括焦虑症，神经紊乱，“肝郁气滞”（低能耗），哮喘和消化等问题。然而，它的降糖作用和机制在体内仍不明确。在我们的前期研究中，我们从重组的大肠杆菌细胞中分离纯化得到了人的PTP1B催化结构域。我们从多种中国传统药物提取物中体外筛选PTP1B的抑制剂。我们发现，厚朴提取物对PTP1B的抑制效果最佳，其IC50为55.96μg/ml。而且，厚朴提取物对PTP1B表现出良好的抑制选择性，对比其他的PTP家族成员，包括SHP1（IC50=501.94μg/ml），SHP2（IC50=521.56μg/ml），TCPTP（IC50=395.59μg/ml）和HePTP（IC50=677.88μg/ml）。酶动力学分析证实，厚朴提取物对PTP1B的抑制类型为可逆的竞争性抑制，其抑制剂常数（Ki）计算为0.049μg/ml。因此，厚朴提取物作为下一步的研究对象，研究其降糖作用。为了确认厚朴提取物是否发生在细胞水平上对PTP1B保持抑制效果，我们用不同浓度厚朴提取物刺激成熟的3T3-L1脂肪细胞和C2C12肌管细胞。我们发现，厚朴提取物能够增加细胞内总蛋白的酪氨酸磷酸化，并存在剂量依赖的效应。而且，厚朴提取物能够增强胰岛素刺激的IRβ和ERK1/2的酪氨酸磷酸化水平，并存在剂量依赖的效应，且不改变其蛋白水平。厚朴提取物还能增强胰岛素刺激的GLUT4向细胞膜的转运，并呈剂量依赖性作用。以上这些结果显示厚朴提取物通过抑制PTP1B的活性来改善胰岛素敏感性，并激活下游信号传导通路，例如ERK1/2的磷酸化和GLUT4转运。为了进一步探讨厚朴提取物的降血糖功效，我们用db/db小鼠（胰岛素抵抗和严重的高血糖）作为2型糖尿病的模型。db/db小鼠每天口服给药—0.5g/kg厚朴提取物，持续5周，其空腹血糖水平与糖尿病对照组小鼠相比明显降低。为了探索厚朴提取物的潜在毒性，我们用不同剂量的厚朴提取物一次性给昆明小鼠口服给药，在给药后观察小鼠的生理状态及死亡数目。我们计算其半数致死量初步评估厚朴提取物的急性毒性，其半数致死量与95％置信度（LD50=2.0±0.2g/kg），这表明厚朴提取物的毒性极小且耐受性良好。最后，我们得出结论，厚朴提取物通过对PTP1B专一的竞争性抑制作用，增强胰岛素信号通路转导，进而促进GLUT4向细胞膜的转运，从而降低db/db小鼠的血糖水平。我们的实验结果证实了厚朴提取物在以PTP1B的为靶点的抗2型糖尿病药物开发中潜力。