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目的: 衰老的进程会导致体内各器官功能衰退，适应性和抵抗力减退等一系列复杂改变。衰老与DNA甲基化之间密切相关。DNA甲基化的升高，可以维持染色质的稳定，延缓衰老及相关性疾病（高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔兹海默病）的发生以及延长寿命。但DNA甲基化或去甲基化是如何调控衰老目前仍不甚清楚。另外，传统抗衰老中药中的异戊烯基黄酮单体是否能延缓衰老以及延缓衰老的机制仍然有待解决。因此，本课题主要研究DNA去甲基化在衰老中的作用，并找到有效延缓细胞衰老的异戊烯基黄酮单体。 方法: 首先，用100μmol/L H2O2刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)1h，构建细胞衰老模型，β-半乳糖苷酶染色法检测衰老细胞的比例，PCR及Western Blot实验检测自然衰老细胞中衰老相关基因p16、p21及p53的表达。最终确定有效延缓细胞衰老的中药单体。 然后，补骨脂查尔酮处理的细胞进行DNA甲基化及羟甲基化测序，分析补骨脂查尔酮对DNA甲基化及羟甲基化的影响。PCR及Western Blot实验检测补骨脂查尔酮对DNA去甲基化酶TET2及TET3的调控。运用C57BL6小鼠观察补骨脂查尔酮在体内对细胞衰老以及DNA羟甲基化的调控作用。 最后，细胞衰老的机制进行研究。自然衰老细胞进行DNA甲基化及羟甲基化测序，并对DNA甲基化及羟甲基化的测序结果进行Go分析、Pathway分析、整体分析及景观分析。Dot Blot及免疫荧光实验检测衰老细胞及衰老小鼠中DNA羟甲基化水平。PCR及Western Blot实验检测多种衰老模型及不同衰老细胞中衰老相关基因p16、p21、p53及DNA去甲基化酶TET2和TET3的表达，PCR实验还检测自然衰老细胞中炎症及心血管相关基因的表达。shRNA分别沉默TET2及TET3检测对细胞衰老的影响，同时TET2及TET3过表达也检测对细胞衰老的影响。运用ChIP实验检测p53、ETS-1与TET3启动子的结合作用以及ETS-1与p53启动子的结合作用。同时运用shRNA分别沉默p53及ETS-1观察对细胞衰老的影响。运用p53杂合子小鼠观察p53对小鼠衰老及DNA羟甲基化的影响。运用Crispr Cas9技术敲除TET3或过表达TET3，观察其对DNA羟甲基化及细胞衰老的影响，以及对炎症基因的调控。同时还运用TET3杂合子小鼠观察TET3基因在小鼠体内对DNA羟甲基化及细胞衰老的影响。 结果: 1.100μmol/L H2O2可以有效诱导细胞衰老;β-半乳糖苷酶染色实验发现补骨脂查尔酮可以有效降低由H2O2诱导的衰老细胞的比例;PCR及Western Blot实验结果表明，补骨脂查尔酮可以有效降低自然衰老细胞中衰老相关基因p16、p21及p53的表达。 2.补骨脂查尔酮可以显著降低衰老细胞的DNA羟甲基化水平，调控位点主要位于Promoter上，同时还能显著降低TET3的表达。体内实验结果表明，补骨脂查尔酮可以显著降低心脏中p16、p21、p53及TET3的表达，并能降低心脏和肾脏的DNA羟甲基化水平。 3.与14代细胞(PD14)相比，34代细胞(PD34)中衰老相关基因的表达显著增加，炎症及心血管功能相关基因的表达也是显著变化的。DNA甲基化及羟甲基化的测序结果表明，在自然衰老细胞中整体基因的DNA甲基化水平变化不明显，而DNA羟甲基化水平显著升高，且DNA羟甲基化升高的位点主要集中在Promoter上。免疫荧光及Dot Blot实验结果表明自然衰老细胞及衰老小鼠的心脏、肾脏及胸主动脉中DNA羟甲基化水平显著升高。PCR实验结果表明，在自然衰老细胞及衰老小鼠的心脏中心血管功能及炎症相关基因的表达也发生显著变化。PCR及Western Blot实验结果表明paraquat可以显著促进HUVEC、HEK293及H9C2细胞中衰老相关基因p16、p21、p53及DNA羟甲基化的表达。 4.PCR及Western Blot实验结果表明，在自然衰老细胞、paraquat诱导的细胞衰老及衰老小鼠的心脏、肾脏和胸主动脉中DNA主动去甲基化酶TET2及TET3的表达显著增加。沉默TET3后，可以显著降低由paraquat诱导的衰老基因p16、p21及p53的表达，但沉默TET2后不能降低p16、p21及p53的表达。而过表达TET3可以显著促进衰老相关基因p16、p21及p53的表达，过表达TET2降低p53的表达。 5.ChIP实验结果表明在自然衰老细胞中p53与TET3启动子的结合显著增加，但ETS-1与TET3启动子的结合无明显变化，同时在p53的结合位点发现RNApolyaseⅡ与TET3启动子的结合也是显著增加的。荧光素酶报告基因实验结果表明，当沉默p53时TET3启动子的荧光素酶活性显著降低，而当过表达p53时TET3启动子的荧光素酶活性显著增加。p53的沉默可以显著降低衰老基因p16、p21、p53以及DNA主动去甲基化酶TET3的表达，同时在p53杂合子(p53+/-)小鼠心脏中p16、p21、p53及TET3的表达也是显著降低的，p53+/-小鼠的心脏、肾脏及胸主动脉的DNA羟甲基化水平也是显著降低的。在自然衰老细胞及衰老小鼠的心脏中ETS-1的表达显著增加，且ChIP实验结果还表明在自然衰老细胞中ETS-1与p53启动子的结合显著增加。ETS-1的沉默可以显著降低其与p53启动子的结合，还能显著降低p53与TET3启动子的结合，且同样能够显著降低衰老细胞中p16、p21、p53及TET3的表达。 6.PCR、Western Blot及CCK8实验结果表明，TET3的敲除可以显著降低p16、p21、p53的表达，同时还可以显著降低炎症相关基因的mRNA表达，促进HUVEC细胞增殖。细胞免疫荧光实验结果表明TET3的敲除可以显著降低DNA羟甲基化水平。DNA羟甲基化测序结果表明，TET3敲除还能调控炎症及代谢相关基因的DNA羟甲基化的景观变化。TET3杂合子（TET3+/-）小鼠中衰老相关基因的表达及DNA羟甲基化水平也是显著降低的，炎症及代谢基因的表达也发生显著变化。而TET3过表达可以抑制细胞增殖，促进炎症及其他衰老相关基因的表达。TET2的过表达抑制部分炎症基因的表达。 结论: 1.补骨脂查尔酮可以有效延缓内皮细胞的衰老。 2.补骨脂查尔酮通过降低DNA羟甲基化水平及TET3的表达调控细胞衰老。 3.与DNA甲基化相比，DNA羟甲基化与细胞衰老的关系更加密切，且DNA羟甲基化的改变主要位于启动子上。 4.TET3参与衰老的调控过程，而不是TET2。 5.ETS-1及p53调控TET3的表达。 6.TET3的敲除可以延缓衰老，降低衰老细胞中DNA羟甲基化水平，并能调控炎症及代谢相关基因的表达及景观变化。