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一．研究背景：
癫痫(epilepsy)是一组由不同病因引起，脑部神经元高度同步化，且常具有自限性的异常放电所致，以发作性、短暂性、重复性及通常为刻板性的中枢神经系统功能失常为特点的综合征。癫痫为一种常见病，国内流行病学调查显示其患病率为5960，全国约有600万～700)万病人，见于各个年龄组，青少年和老年是癫痫发病的两个高峰年龄段。经过规范化的抗癫痫药物(AEDs)治疗，可以使80％以上患者的发作得到有效控制，有相当一部分停药后可终生不再发病，但仍有20％左右的患者对常见的一线抗癫痫药物耐药，需要选用多种药物联合应用或使用新的抗癫痫药，如仍无效则考虑外科手术治疗，称为难治性癫痫(intractableepilepsy)。
局灶性皮质发育不良(focal cortical dysplasia，FCD)是导致难治性癫痫的重要病因。2005年至2007年，首都医科大学宣武医院功能神经外科手术切除的全部难治性癫痫患者脑组织标本中，病理诊断为FCD的病例约占50％(133/275)。其在病理组织学上的改变包括：皮质层状排列紊乱、灰质异位、分子层神经元残留、灰质中神经元簇集以及各类异常神经元的出现。目前认为是胚胎时期(乃至出生后)皮质形成过程中某些环节的异常导致了这一严重后果。
FCD的致痫性首先由皮层脑电监测证实——即痫性放电主要来源于发育不良的脑回；接受发育不良皮层切除手术的多数患者预后良好也证明了FCD与难治性癫痫的相关性。
近年来逐渐形成了以谷氨酸为代表的兴奋性神经递质和以γ-氨基丁酸为代表的抑制性神经递质之间不平衡造成FCD致痫性的假说。人们也试图利用分子生物学、电生理和免疫组织化学等方法来探讨上述氨基酸类递质受体及系统的特点与FCD致痫性之间的联系。当前，对兴奋性氨基酸受体作用的探讨多集中于以N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)为代表的谷氨酸受体；而对抑制性氨基酸系统的研究除着眼于受体本身外，学者们又将释放γ-氨基丁酸(γ-GABA)的抑制性中间神经元纳入了视野。由于手术标本匮乏，国内尚无针对FCD全部4种亚型中NMDA受体和γ-GABA能系统成份表达情况的研究。而揭示NMDA受体、γ-GABA能系统发生致痫性变化的分子机制，可以使某种神经递质的功能成像成为新的诊断方法，同时对开发出针对某种特异性神经递质受体的抗癫痫药物也具有一定的现实意义。
二．研究目的：
通过对NMDA受体亚单位NR2A/B以及作为释放γ-氨基丁酸的中间神经元标记物钙结合蛋白-D-28k(calbindin-D-28k，CB)、微小清蛋白(parvalbumin，PV)在FCD全部4种亚型脑组织中表达部位及含量的比较研究，促进阐明NMDA受体、γ-GABA能系统发生致痫性变化的机制。
三．材料与方法：
1.免疫组织化学：选取20例难治性癫痫患者手术切除脑组织标本作为病例组，病理诊断包括FCD四种亚型，选取4例无癫痫发作病史的胶质瘤患者的病灶周围脑组织标本作为对照组。部分脑组织标本经20％PBF固定后切片，应用Envision二步法进行免疫组织化学标记，观察NR2A/B和PV在FCD病变脑组织中的表达部位和表达强度。确立对PV免疫组化染色的评估体系如下：
a．背景染色最强区域每高倍视野(x40倍)中PV阳性神经元数量评分。
b．PV免疫组化反应的背景染色评分。
c．低倍镜下(×4倍)PV阳性神经元条带排列紧凑程度评分。
总分=a+b+c，最小值1分，最大值为10分。
根据组织学上的特点，将全部FCD病例再细分为ⅠA型、ⅠB型、ⅡA病灶、ⅡA灶旁、ⅡB病灶和ⅡB灶旁共6类区域，随后计算对照及FCD6类区域内PV阳性神经元平均数；应用SPSS for Windows Vcr．11.5统计分析系统对各组PV阳性神经元平均数行秩和检验(Rank Sum Test)。上述6类区域及对照皮层采用均数±标准差或中位数表示PV染色评分的平均水平。 2.Western-Blot：选取16例难治性癫痫患者手术切除脑组织标本作为病例组，病理诊断包括FCD全部四种亚型，其中ⅡA及ⅡB又各自分为ⅡA病灶、ⅡA灶旁、ⅡB病灶和ⅡB灶旁。选取4例无癫痫发作病史的脑肿瘤患者的病灶周围脑组织标本作为对照组。部分脑组织标本经—80℃低温冰箱冻存后进行匀浆、离心，取上清，应用Western-Blot法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经ECL法显影后，得到PV和CB两种待测蛋白条带；残渣重悬后再取上清，应用Western-Blot法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经ECL法显影后，得到NR2A/B蛋白条带。应用ImageJ 1.38x图像分析系统对所得结果进行分析，从而得到待测蛋白条带与内参actin的相对灰度。应用SPSS for Windows Ver．11.5统计分析系统对各组的相对灰度行秩和检验(Rank Sum Test)。
四．实验结果：
1.NR2.A/B；免疫组织化学染色中对照皮层的锥体神经元中NR2 A/B不表达；而在FCD皮层中的未成熟神经元、巨大神经元及形态异常神经元中有显著NR2 A/B表达，并以未成熟神经元的胞浆及突起内为著。Western-Blot证实FCD各亚型皮层中NR2A/B蛋白含量均较对照皮层增多，具有显著差异；ⅠB与ⅠA、ⅡA病灶与ⅡA灶旁、ⅡB灶旁与ⅡB病灶三组间分别两两比较，NR2 A/B蛋白含量增加，均有显著差异。
2.PV：免疫组织化学染色中与对照相比，FCD皮层的PV阳性神经元呈分散排列，同时阳性神经元的数量及背景染色都有显著下降，上述改变尤以FCDⅡ型病灶区最为明显。Western-Blot证实FCD各亚型中PV蛋白含量较对照皮层减少，具有显著差异；此外，ⅡA病灶与ⅡA灶旁、ⅡB病灶与ⅡB灶旁相比PV蛋白含量减少，也有显著差异。
3.CB：Western-Blot证实FCD各型皮层中CB蛋白含量虽然比对照皮层少，但是只有ⅡB病灶与对照之间有显著差异；此外，ⅡA病灶与ⅡA灶旁、ⅡB病灶与ⅡB灶旁相比CB蛋白含量减少，也有显著差异。
五．结论：
1.FCD皮层内同时存在兴奋性氨基酸受体的高表达以及抑制性中间神经元数量减少和排列紊乱。
2.NR2 A/B在FCD各亚型中表达均显著升高，其表达在ⅠB最高。在Ⅱ型皮层呈明显局灶性，在ⅡA病灶中比灶旁表达高，ⅡB灶旁比病灶表达高。
3.PV在FCD各亚型中表达均显著下降，并且其表达下降在FCD Ⅱ型皮层呈明显局灶性。
4.尽管CB表达下降在FCD ⅡB型皮层呈明显局灶性，但是其表达下降在FCD其他亚型中无显著差异。推测CB可能有继发于癫痫的新表达。