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背景及目的
新生儿肺出血(neonatalpulmonaryhemorrhage,NPH)是新生儿期危重急症之一，围产期缺氧/窒息是NPH的主要病因之一，其主要病理生理改变为肺动脉高压和肺血管内皮细胞损伤。缺氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor-1HIF-1)是机体细胞适应低氧的主要中介物质，通过它进而对一系列的缺氧反应基因进行转录调节，从而产生一系列的病理生理反应。内皮素-1(endothelin-1,ET-1)是血管内皮细胞分泌的一种重要的缩血管因子，ET-1基因是缺氧反应基因之一。我们的前期研究工作初步证实HIF-1α可通过调节ET-1而参与内皮细胞损伤及肺出血的形成。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，RNAi技术目前已成为一种研究基因功能的有力工具。该研究目的是通过构建HIF-1α基因的小干扰RNA(smallinterfereRNA，siRNA)真核表达载体(pSIREN-Shuttle/HIF-1αsiRNA)，观测其对HIF-1α基因的沉默作用及对ET-1的调控抑制作用；并构建复制缺陷型HIF-1αsiRNA重组腺病毒质粒载体(pAdeno/HIF-1αsiRNA)，以期为下一步利用该载体进行在体内新生儿肺出血的发病机制及防治的研究奠定实验基础。
方法
1、选择6个(A～F)可能的HIF-1αsiRNA干扰位点序列及设计合成相应的互补寡聚核苷酸链，退火形成双链寡聚核苷酸后，利用亚克隆技术构建6个相应的HIF-1αsiRNA真核表达载体pSIREN-Shuttle/HIF-1αsiRNA(A～F)，双酶切法及DNA测序鉴定重组载体的正确性。
2、利用脂质体介导的基因转染方法，将pSIREN-Shuttle/HIF-1αsiRNA(A～F)分别导入到人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，转染48小时后，用CoCl2处理细胞，进行模拟缺氧3小时。RT-PCR检测转染细胞中HIF-1αmRNA水平，WesternBlot检测转染细胞中HIF-1α蛋白水平，ELISA检测转染细胞培养上清中的ET-1水平。
3、利用基因重组技术构建HIF-1αsiRNA重组腺病毒质粒载体pAedenoHIF-1αsiRNA(A-F)。酶切法将pAdeno/HIF-1αsiRNA(A～F)线性化，脂质体法将其转染包装细胞(HEK293细胞)，获得HIF-1αsiRN(A～F)重组包装病毒。PCR双引物法鉴定重组包装病毒是否带有HIF-1αsiRNA干扰位点序列。
结果
1、经酶切及DNA测序证实，HIF-1αsiRNA双链寡核苷酸序列已准确无误定向插入pShuttle穿梭载体中，成功构建了含HIF-1αsiRNA双链寡核苷酸序列的重组穿梭质粒载体。
2、脂质体介导将pSIREN-Shuttle/HIF-1αsiRNA转染至HUVECs，其中有B、D两个pSIREN-Shuttle/HIF-1αsiRNA明显抑制CoCl2模拟缺氧刺激后HUVECs中HIF-1αmRNA、HIF-1α蛋白及ET-1的表达，并提示ET-1表达水平与HIF-1α表达水平呈正相关。
3、将含独立表达框的HIF-1αsiRNA双链寡核苷酸序列亚克隆到E1和E3区缺陷的腺病毒基因组载体中(pAdeno-X)，获得HIF-1αsiRNA重组腺病毒质粒载体(pAdeno/HIF-1αsiRNA)。脂质体介导将PacⅠ线性化的pAdeno/HIF-1αsiRNA转染至包装细胞，获得HIF-1αsiRNA重组包装病毒，双引物PCR鉴定表明成功构建缺陷型HIF-1αsiRNA重组包装病毒。
结论
1、成功构建了6个HIF-1αsiRNA真核表达载体pShuttle/HIF-1αsiRNA及缺陷型(E1和E3区缺陷)的HIF-1αsiRNA重组包装腺病毒。
2、特异性HIF-1αsiRNA真核表达载体能明显干扰HIF-1α基因的表达，进而抑制其下游靶基因ET-1的表达释放。但并非所有符合siRNA设计标准的序列都是有效的干扰位点，结合在同一靶mRNA不同位点上的siRNA相对抑制效率有所不同。本实验所选的B、D位点为有效靶位点，而其它4个位点可能为非有效靶位点。
背景及目的：
HIF-1是一种缺氧激活的转录因子，缺氧通过它诱导低氧反应基因的表达，从而产生一系列的适应性反应，但低氧环境下，细胞是通过何种信号转导通路产生活化HIF-1还未完全清楚。目前对于细胞的低氧感受信号转导通路的学说主要有四种，其中认为NADPH氧化酶是氧感受器，缺氧导致细胞内氧化还原状态发生改变是调节HIF-1活性的重要因素。机体对缺氧产生的反应是一个非常复杂的过程，不同机体细胞可能有不同的信号转导通路，对NADPH氧化酶在内皮细胞(endothelialcells，ECs)氧感受方面的作用还需进一步研究证实。该实验拟用NADPH氧化酶的特异性抑制剂夹竹桃麻素和外源性H2O2处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，探讨NADPH氧化酶对ECsHIF-1α表达的影响。
方法：
培养的HUVECs分为常氧对照组、缺氧组、NADPH氧化酶抑制剂组、H2O2+缺氧组、H2O2+NADPH氧化酶抑制剂组，处理3小时后WesternBlot检测转染细胞中HIF-1α蛋白水平，ELISA检测转染细胞培养上清中的ET-1。
结果：
常氧对照组基本检测不到HIF-1α蛋白的表达，缺氧及NADPH氧化酶抑制剂组HIF-1α蛋白表达及ET-1水平升高，H2O2明显抑制缺氧和NADPH氧化酶抑制剂刺激后HUVECsHIF-1α的表达，但明显增加ET-1水平。
结论：
NADPH氧化酶作为内皮细胞的氧感受器，缺氧通过调节其活性而改变细胞内氧化还原状态，间接调控HIF-1α。ET-1表达除受HIF-1的调控外，还存在其它调控机制。