论文部分内容阅读
目的:
世界范围内，胃癌是第2大癌症相关死亡原因。胃癌的发生是1个复杂、多步骤、多因素的事件，很多致病因子可以促进胃癌的发生和发展。胃泌素(gastrin)可能在胃癌发生中具有重要作用。胃泌素通常由胃窦和十二指肠近端黏膜的G细胞分泌，主要通过与胃泌素受体结合来实现其效应。胃泌素能刺激胃酸分泌和胃上皮细胞的增殖，并能使壁细胞和ECL细胞的数量增加，与胃癌的形成和生长有关。
RegⅠ(regeneratingⅠ)是Reg再生蛋白基因家族的1员。国外近年的研究表明，RegⅠ蛋白在胃癌组织中高表达；RegⅠ基因的表达与胃癌的分化程度、浸润性生长的程度以及患者的预后情况均存在相关性。胃癌细胞中，胃泌素可以促进RegⅠ基因的表达。前期的研究表明，RegⅠ基因沉默的胃癌细胞，胃泌素促进胃癌细胞生长的效应明显下降，RegⅠ基因可能是胃泌素促进胃癌细胞生长通路的关键下游基因。但是，胃泌素调控RegⅠ基因表达的分子机制尚不清楚。
真核细胞的转录调控由顺式作用元件(cis-acting elements)和反式作用因子(trans-acting factors)相互作用实现。后者又称为转录因子（transcriptionfactors，TFs），它能够识别特定的DNA顺式作用元件并与之结合，从而调控细胞的基因表达，对细胞增殖及肿瘤形成、转化和凋亡有很大的影响。
本研究应用巢式PCR技术克隆RegⅠ基因上游启动子1414bp片段，应用随机引物法以地高辛标记RegⅠ基因启动子片段为探针。应用Southwestern blot技术观察胃泌素对胃癌细胞SGC7901 RegⅠ基因转录因子的效应，探讨胃泌素促进胃癌细胞RegⅠ基因表达的分子机制。
材料与方法:
1．克隆RegⅠ基因启动子应用巢式PCR技术以胃癌细胞SGC7901基因组DNA为模板扩增RegⅠ基因启动子1414bp片段，将扩增片段插入T载体，XbaⅠ/PstⅠ双酶切、菌液PCR及测序鉴定。
2．探针制备将RegⅠ基因启动子1414bp片段及其HindⅢ酶切后的近端614bp(-573/+41)和远端800bp(-1373/-574)片段，应用随机引物法以地高辛标记为探针，应用DNA斑点杂交法检测探针的灵敏度。
3．胃泌素孵育胃癌细胞将培养的胃癌细胞SGC7901随机分为3组：实验组1，加入终浓度为10-8mol/L胃泌素的培养液；实验组2，加入终浓度为10-7mol/L胃泌素的培养液；对照组，不含胃泌素。培养48h，分别提取核蛋白。
4．Southwestern blot3组胃癌细胞核蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜。分别应用1414bp、近端614bp和远端800bp探针进行Southwestern印迹实验，检测3组细胞核蛋白对探针的结合效应。各条带的灰度值应用QuantityOne软件进行分析。
5．统计学分析实验数据以均数±标准差表示，应用SPSS11.5统计软件进行分析。总体均数的比较采用单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
6．RegⅠ基因启动子的TFs结合位点分析应用MatInspector在线分析软件分析RegⅠ基因启动子1414bp片段的TFs结合位点。
结果:
1．RegⅠ基因启动子的克隆克隆的RegⅠ基因启动子1414bp片段，经XbaⅠ/PstⅠ双酶切及DNA序列分析验证，插入片段正确，DNA序列与GenBank报道的一致。
2．探针制备1414bp及近端614bp和远端800bp片段，经地高辛标记的探针灵敏度达1pg/μl。
3．Southwestern印迹结果1414bp探针检测结果显示，胃癌细胞SGC7901显示20条不同分子量的TFs主带；对照组与处理组相比，带型没有变化，但一些带的灰度发生了变化。实验组带9、12、13、14、15和166条主带的灰度值明显低于对照组(P＜0.05)；两实验组比较，6条主带的灰度值无明显差异(P＞0.05)。614bp探针检测结果显示，上述6条变化主带检测到带9、12和133条主带，实验组3条主带的灰度值明显低于对照组(P＜0.05)；两实验组比较，3条主带的灰度值无明显差异(P＞0.05)。800bp探针检测结果显示，上述6条变化主带检测到带9、12和143条主带，实验组带14的灰度值明显低于对照组(P＜0.05)；两实验组比较，带14的灰度值无明显差异（P＞0.05）。614bp和800bp探针均未检出带15和带16。
4．RegⅠ基因启动子TFs结合位点分析应用在线分析软件MatInspector分析RegⅠ基因启动子1414bp片段，结果显示，1414bp片段含有48种矩阵的172个TFs潜在结合位点。
结论:
1．胃癌细胞SGC7901 RegⅠ基因可能由包括活化子和抑制子的多个转录因子共同调控。
2．胃泌素可能通过降低抑制子的结合活性上调胃癌细胞SGC7901 RegⅠ基因表达。