论文部分内容阅读
本论文以我国南方主要海水经济鱼类之一-红笛鲷(Lutjanussanguineus)为研究对象。以灭活哈氏弧菌(Vibrio harveyi)ZJ0706体内诱导红笛鲷为实验组，以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组，通过抑制性消减杂交技术构建红笛鲷头肾消减cDNA文库。利用PCR技术获得了2424个含插入片段的阳性克隆，并利用斑点杂交技术筛选了680个克隆进行了序列测定。差减文库的构建共获得587条高质量的ESTs序列。通过生物信息学分析，将所获得的ESTs分为5大类：免疫防御相关蛋白基因，共30种；细胞周期/DNA复制/蛋白调控/转录/翻译相关蛋白基因，共29种；细胞代谢/呼吸链相关蛋白及核糖体蛋白基因数量分别为26和24种；转运相关蛋白基因，共4种。
应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了5个免疫相关基因的全长cDNA序列。它们分别是热休克蛋白10(HSP10)基因、髓系分化因子88(MyD88)基因、组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因、免疫球蛋白M重链和轻链(IgH和IgL)基因。它们的cDNA序列全长分别为529 bp、1684 bp、1369 bp、2046 bp和1031 bp，编码99、290、354、595和241个氨基酸残基。
BLAST分析显示红笛鲷HSP10，MyD88、MHCⅠα、IgH和IgL与其他已知物种相应基因的最高同源性为分别为88％、88％、84％、80％和91％。多重比较证实HSP10和MyD88是高度保守的，而MHCⅠα、IgH和IgL变异较大。软件预测显示，论文涉及的5个基因中只有MHCⅠα、IgH和IgL具有信号肽序列，且MHCⅠα还含有跨膜结构域，而其他基因既不具有信号肽序列也不具有跨膜结构域。构建的系统进化树分析显示，红笛鲷HSP10、MyD88、MHCⅠα、IgH和IgL分别与裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)，鳜(Siniperca chuatsi)、石斑鱼(Epinephelus coioides)、大黄鱼(Larimichthys crocea)和石斑鱼的相应基因亲缘关系较近。另外，PSORTⅡ Prediction结果为，HSP10和MyD88编码的蛋白主要分布于细胞质，几率分别为60.9％和69.6％；MHCⅠα编码的蛋白主要分布于内质网(44.4％)和高尔基体(33.3％)；而免疫球蛋白M重链和轻链主要分布于细胞外，几率分别为55.6％和44.4％。
以β-actin基因为内参，应用Real-time RT-PCR技术研究了HSP10、MyD88、MHCⅠα、IgH和IgL mRNA在哈氏弧菌ZJ0706感染后3 h、6 h、9 h、15 h、24h、36 h及48 h在红笛鲷头肾中的表达模式及感染前后在头肾、脾脏、胸腺、肝脏、心脏、脑、肌肉和肠中的表达变化。结果表明，HSP10、MyD88、MHCⅠα、IgH和IgL在头肾中都能检测到相应mRNA的表达，且HSP10、MyD88和MHCⅠα最大表达量都出现在诱导后6～15 h内；不同组织间的比较发现，哈氏弧菌ZJ0706感染后15h HSP10 mRNA的最大表达量出现在脾脏中，而MyD88和MHCⅠαmRNA的最大表达量出现在肝脏中。另外，免疫球蛋白mRNA的表达量在48 h内随时间的延长而呈现持续上调状态且主要在头肾、脾脏、胸腺及肝脏中表达，在脑中表达量最小。
将HSP10、MyD88、MHCⅠα和IgH基因分别亚克隆到原核表达载体pET32a(+)或pET28a(+)中，构建原核表达质粒pET32-HSP10、pET28-MyD88、pET32-MHCⅠα和pET28-IgH。经IPTG诱导后它们在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了大量表达。优化表达条件后对重组蛋白进行纯化并利用纯化后的重组蛋白按常规方法免疫新西兰纯种大白兔，制备了多克隆抗体。ELISA检测显示，所获得的4种抗血清效价均介于1:30000到1:40000之间。Western blot检测发现，本实验制备的抗血清均能特异性的与相应的重组蛋白发生抗原抗体反应。
本研究还在红笛鲷头肾及脾脏组织冰冻切片的基础应用制备的抗血清对HSP10和MyD88进行了免疫组化分析。结果显示，不管是在头肾细胞还是在脾脏细胞中，HSP10和MyD88都主要分布于细胞质，细胞核中也有分布。
本论文的研究结果对探讨红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制具有重要意义；丰富和发展了鱼类分子免疫学的研究内容；为进一步改善红笛鲷的抗病力和免疫防御能力的研究打下坚实基础。