论文部分内容阅读
目的： 新型碳青霉烯酶NDM是一种能使肠杆菌科细菌对碳青霉烯类、头孢菌素类及青霉素类抗菌药物敏感性降低甚至耐药的B类金属酶。自2009年首次发现产新德里金属酶(NDM-1)“超级细菌”以来，产NDM-1的菌株在全世界范围内播散开来。碳青霉烯类抗菌药物作为治疗多重耐药菌院内感染的首选药物，由于抗菌药物的不合理使用，临床上对碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌越来越多。与此同时，革兰阴性细菌中已经发现16种NDM的变异体，其中编码NDM-13的blaNDM-13是最新在尼泊尔发现的一种在染色体上的碳青霉烯酶基因。本研究为了检测blaNDM-13是否定位于肠杆菌科细菌临床分离株的质粒上，通过对耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌进行表型筛查和相关耐药基因检测方法，来了解本地区肠杆菌科细菌携带blaNDM的情况；通过接合/转化试验和分子生物学方法来分析blaNDM-13的基因定位情况；通过研究承载blaNDM-13的载体质粒结构特点，来探索NDM耐药基因的转移和播散机制。 方法： 采用VITEK全自动微生物鉴定及药敏分析系统对2013年1月至2016年12月分离自温州医科大学附属第一医院的245株碳青霉烯类抗生素（亚胺培南或美罗培南或厄他培南）耐药的肠杆菌科细菌进行菌种鉴定和体外药敏试验。随后用常见碳青霉烯酶耐药基因和ESBLs耐药基因引物对blaNDM-13阳性株进行PCR扩增电泳分析，通过DNA测序来鉴定blaNDM基因型别。用大肠埃希菌EC600作为受体菌、大肠埃希菌DH5α作为感受态细菌分别与blaNDM-13阳性菌进行接合和转化试验来证实携带blaNDM-13的质粒可转移性。同时采用改良Hodge试验、金属酶初筛试验、ESBLs双纸片协同试验来对blaNDM-13阳性菌以及接合/转化子进行表型确证试验。在此基础上，我们运用MLST多位点序列分型来确认blaNDM-13阳性菌的克隆 ST型，运用 S1-PFGE-Southern杂交来对目标菌携带的blaNDM-13进行质粒基因定位，进而通过全质粒测序对从转化子中抽提出来的blaNDM-13质粒的结构特点和传播机制进行深入探讨。 结果： 1.菌种鉴定和耐药基因检测：245株待测菌为碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌，其中携带blaNDM-13有2株。通过测序发现从临床尿液标本分离到的一株大肠埃希菌（被命名为E.coli DC33）同时携带blaNDM-13和blaSHV-12，从脓液标本中分离到的一株大肠埃希菌(被命名为E.coli DC2504)也携带有blaNDM-13。 2.MLST分型和PFGE型：选用大肠埃希菌的7个管家基因，通过PCR和DNA测序获得每个管家基因的信息，再将每个管家基因的序列号输入数据库进行匹配分析，得出E.coli DC33为ST5138和E. coli DC2504为ST167；PFGE结果显示E.coli DC33和E.coli DC2504这两株细菌为不同克隆型。 3.接合和转化试验：以大肠埃希菌EC600作为受体菌，与 blaNDM-13阳性菌通过交配共轭方式，经利福平和亚胺培南筛选平板成功获得接合子；以大肠埃希菌DH5α作为感受态细胞，从blaNDM-13阳性菌分离株中抽提出来的质粒通过化学方法转入感受态细胞，经亚胺培南筛选平板成功获得转化子，经PCR扩增电泳分析，接合子/转化子DC33和接合子DC2504均携带blaNDM基因。 4.β内酰胺酶表型确证试验：E.coli DC33和接合子/转化子DC33及E.coli DC2504和接合子DC2504的改良Hodge试验均为阳性，EDTA双纸片金属酶初筛试验均为阳性，E.coli DC33经CLSI推荐的通过头孢他啶/克拉维酸和头孢他啶以及头孢噻肟/克拉维酸和头孢噻肟双纸片协同法检测ESBLs的结果为阳性，而E.coli DC2504的ESBLs确证试验结果为阴性。 5.药敏试验：E.coli DC33对所有β-内酰胺类抗生素均耐药，对呋喃妥因中介，对替加环素敏感，E.coli DC2504对呋喃妥因敏感，其余同E.coli DC33。用E-Test条再次验证E.coli DC33对IPM和MEM耐药，且微生物自动分析仪药敏结果显示接合子和转化子对亚胺培南和美罗培南均耐药。 6.质粒酶切结果：E.coli DC33和E.coli DC2504的接合子经限制性内切酶EcoR I酶切，发现接合子DC33和接合子DC2504携带blaNDM-13的质粒相同。 7.质粒基因定位：通过对E.coli DC33先进行S1核酸酶消化，再通过PFGE分离获得54Kb左右的DNA条带，用携带blaNDM-13的探针进行Southern杂交确定blaNDM-13位于质粒上。 8.全质粒测序：将从转化子中抽提出的质粒（pNDM13-DC33）进行序列测序，结果显示该质粒全长54.035Kb，平均GC含量49.03％；由33Kb的骨架区和21Kb的耐药可变区组成。耐药可变区GC含量高，包括16个开放读码框，这16个开放读码框分别是IS26-blaSHV-12-ygbI-ygbJ-IS26-insE-groLE-cutA1-dsbc-△trpF-bleMBL-blaNDM-13-ISAba125-IS5-ISAba125-Tn3 tnpA，其中blaNDM-13位于△ISAba125的下游。 结论： 1.首次发现质粒介导的blaNDM-13； 2.在中国首次在肠杆菌科细菌中发现blaNDM-13； 3.尽管blaNDM-13检出率还非常低，但应警惕其在不同菌株和菌种间的播散。