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久效磷是一种高效内吸性有机磷杀虫剂。虽然我国从2007年开始全面禁止使用久效磷,但在近年来的食品农药残留检测中,仍然检测出久效磷农药残留。久效磷对环境的污染和对生态的破坏引起了人们的高度重视。久效磷在环境中的降解,主要有光化学降解、化学降解和生物降解三种形式。微生物在久效磷的降解中起重要作用。本研究分离、筛选久效磷降解菌株,研究菌株对久效磷的降解产物和代谢途径,同时克隆降解久效磷的相关基因,为污染环境的生物修复提供生物材料和科学依据。一、久效磷降解菌株的分离和鉴定以久效磷为底物,以江苏江都和湖南郴州水稻田采集的土样作为接种物,通过连续富集培养的方法得到降解久效磷的富集液,从江都富集液中分离到了两株菌YW1和YW16,从湖南富集液中分离到了YW6。紫外扫描（UV）和高效液相色谱（HPLC）检测显示,YW6和YW16具有从头降解久效磷的功能,菌株YW1不能从头降解久效磷。通过生长实验发现菌株YW1和YW6能以N-甲基乙酰基乙酰胺为唯一碳源生长而YW16不能以其为唯一碳源生长,因此我们推测在江都土样富集培养的过程中,YW1利用了YW16降解久效磷的产物N-甲基乙酰基乙酰胺为碳源生长,形成菌群联合降解久效磷的体系。由于N-甲基乙酰基乙酰胺分子量小,用UV和HPLC都无法检测,本文暂不研究YW1的降解特性。在后续的研究中,我们将以YW6和YW16为材料研究其降解久效磷的机制。根据16S rRNA基因序列相似性和生理生化特征分析,将YW1鉴定为Comamonas sp.,将YW6鉴定为Starkeya sp.,将YW16鉴定为Sphingobium sp.。根据16S rRNA基因系统发育分析,菌株YW1为丛毛单胞菌属中的一个潜在新种,因此我们对它的分类地位进行了详细研究。根据16S rRNA基因序列进行比较发现菌株YW1与C.aquatica LMG 2370T同源性为98.5%,与C.kerstersii LMG 3475T同源性为97.7%,与C.terrigena LMG 1253T同源性为97.7%,与Comamonas属的其它菌种同源性均小于97%,且在发育树上与C.aquatica LMG 2370T构成了一个独立的分支。菌株YW1主要呼吸醌组分为Q-8,G+C mol%含量为65.3 mol%,细胞脂肪酸中主要为C16:0（30.1%）、summed feature 3（C16:1ω6c和/或C16:1ω7c;25.4%）、summed feature 8（C18:1ω6c和/或C18:1ω7c;15.3%）、C17:0 cyclo（7.4%）和C14:0（5.8%）。菌株YW1主要极性脂组分为DPG（双磷脂酰甘油）、PG（磷脂酰甘油）、PE(磷脂酰乙醇胺、PL（未知磷脂）和L（未知脂）,菌株YW1与C.aquatica LMG 2370T、C.kerstersii LMG 3475T和C.terrigena LMG 1253T DNA-DNA同源关系分别为31.5±3.9%、21.6±6.6%和17.2±4.4%。根据以上实验数据,我们最终确定YW1为丛毛单胞菌属的一个新种,命名为Comamonas jiangduensis sp.nov.。二、菌株YW16降解久效磷的特性及有机磷水解酶基因opdA的克隆和表达通过研究发现菌株Sphingobium sp.YW16降解久效磷的最适温度为30℃,最适pH为7.0-7.5,外加碳源会促进其降解,浓度大于2 mM的久效磷对降解有较强的抑制作用。能以磷酸二甲酯为唯一碳源生长,能降解毒死蜱、敌敌畏、杀螟硫磷、三唑磷、辛硫磷、对硫磷等多种有机磷农药。通过GC-MS检测了菌株YW16降解久效磷的代谢产物,发现YW16降解久效磷的第一步反应是水解磷酸酯键,产生相应的代谢产物N-甲基乙酰基乙酰胺和磷酸二甲酯。菌株YW16可以利用磷酸二甲酯为碳源生长,不能利用N-甲基乙酰基乙酰胺生长。我们推测其对久效磷的降解是不彻底的,它并不能完全矿化久效磷,只是破坏了久效磷的磷酸酯键结构。基于菌株YW16在含有毒死蜱的LB平板上因降解毒死蜱而产生水解圈的特性构建基因文库,通过鸟枪法克隆到包含有机磷农药水解酶基因opdA的DNA片段长度为6,214 bp,通过SEFA-PCR对opdA上游的序列进行了染色体步移,得到了包含opdA整个基因簇,总长为7107 bp,有6个ORF,对它们编码蛋白的氨基酸序列进行分析发现第一个ORF编码的蛋白与已报道的有机磷农药降解菌Agrobacterium tumefaciens P230中的转座酶相似性为100%,与Escherichia coli中的IS6100转座酶相似性为99%;第二个ORF编码的蛋白与Agrobacterium tumefaciens P230中的整合酶相似性为95%,与Sphingomonas wittichii RW1质粒pSWIT02中的整合酶相似性为88%;第三个ORF编码的蛋白与Agrobacterium tumefaciens P230中的协助转座酶的ATP结合蛋白相似性可达到99%,与Sphingomonas wittichii RW1质粒pSWIT02中的ATP结合蛋白的相似性为88%;第四个ORF编码的蛋白与Agrobacterium tumefaciens P230中的有机磷水解酶OpdA相似性为99%,与Sphingobium fuliginis ATCC 27551和Brevundimonas diminuta中的有机磷水解酶OPH蛋白的相似性为88%第五个ORF编码的蛋白与已报道的有机磷农药降解菌Sphingobium fuliginis ATCC 27551中的对硝基苯酚水解酶的相似性为91%;第六个ORF与Sphingobium sp.SYK-6中的接合转移蛋白的相似性为69%。有机磷降解酶基因opdA可在细菌间进行水平转移,使本来不具有降解基因的细菌获得有机磷农药降解能力,从而使微生物群落能够适应污染环境。构建了表达菌株E.coli BL21（DE3-pET-opdA）,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后获得纯酶,并表征了重组酶OpdA的酶学特性。在温度为40℃,pH为9.0的条件下酶活性最高。1 mM的Cu2+能显著的抑制OpdA酶活,Co2+、Zn2+对酶活性有一定的促进作用,OpdA能催化水解多种有机磷农药。研究发现该酶对不同的农药降解速率不同,我们猜测这可能跟农药构象有关,还有待进一步的研究。三、菌株YW6对久效磷的降解特性及其代谢途径研究通过研究发现菌株Starkeya sp.YW6可完全矿化久效磷,最适降解温度为30℃,最适降解pH值为7.0-7.5。添加麦芽糖和葡萄糖抑制菌株YW6对久效磷的降解,增大接种量和通气量都会促进久效磷的降解,浓度大于0.6 mM的久效磷对降解有较强的抑制作用。此外,菌株YW6能够降解毒死蜱、二嗪磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、敌敌畏、敌百虫。通过GC/MS进行产物鉴定,推测菌株Starkeya sp.YW6对久效磷的代谢途径为磷酸二己基（E）-1-甲基-2-（甲基羰基）乙烯基酯转化为磷酸二己基（Z）-1-甲基-2-（甲基羰基）乙烯基酯,磷酸二己基（Z）-1-甲基-2-（甲基羰基）乙烯基酯水解生成N-甲基乙酰基乙酰胺。通过对N-甲基乙酰基乙酰胺添加甲基生成N-甲基-4-氧-戊酰胺。N-甲基-4-氧-戊酰胺转化为5-（甲基氨基）-5-氧-戊酸,5-（甲基氨基）-5-氧-戊酸水解生成戊二酸和甲胺。我们从代谢产物的水平上推测出了菌株YW6对久效磷的代谢途径,这为从基因和酶水平解析久效磷的降解机制提供了理论基础。四、菌株YW6中降解久效磷相关基因mmH的克隆和表达鉴于YW6能以久效磷的中间代谢产物N-甲基乙酰基乙酰胺为唯一碳源、氮源生长,同时发现该菌株能在含对乙酰氨基酚的LB平板上因水解其酰胺键而变为褐色。而N-甲基乙酰基乙酰胺和乙酰氨基酚都含有酰胺键,因此,我们以对乙酰氨基酚作为底物通过鸟枪法构建YW6的基因文库,试图克隆能够断裂N-甲基乙酰基乙酰胺中酰胺键的酰胺酶基因。通过筛选从文库菌的阳性克隆中获得一个酰胺酶基因,命名为mmH。mmH含有1476个碱基,编码492个氨基酸,推测分子量为52,467 Da。其编码蛋白的在氨基酸水平上与酰胺酶特征家族相似性较高,有一个催化保守区,与来源于Bacterium CSBL00001的芳基酰基酰胺酶相似性最高为50%。氨基酸序列比对发现其有酰胺酶特征家族最保守的Ser-Ser-Lys催化中心,以及G-（GAV）-S-（GS）2-GX-（GSAE）-（GSAVYCT）-X-（LIVMT）-（GSA）-X6-（GSAT）-X-（GA）-X-（DE）-X-（GA）-X-S-（LIVM）-R-X-P-（GSACTL）序列基元,初步推断该酶为酰胺酶特征家族的新成员。为了验证mmH与降解久效磷的相关性,我们将YW6中的mmH基因插入失活,得到突变菌株YW-DM,通过生长试验和生物转化的方法鉴定菌株YW-DM不能利用久效磷作为唯一的氮源进行生长。在生物转化实验中,YW-DM虽然能够转化久效磷,但因为下游代谢途径的破坏,在以0.2 mM久效磷为唯一氮源的培养基中,YW-DM的生长受到了抑制,表明YW6中的酰胺酶作用于久效磷下游底物的降解。构建表达菌株E.coli BL21（DE3-pET-mmH）,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后获得纯酶。SDS-PAGE分析显示大小为53 kDa,和预测的分子量（52,467 Da）大小一致。MmH最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0。1mM的Hg2+能强烈抑制MmH的酶活力,1mM的Mn2+、Mg2+能使酶活增强10%,1mM Co2+、Ca2+对MmH酶活力有轻微抑制作用,Cu2+、Ni2+、Zn2+抑制30-40%的酶活。此外,金属离子螯合剂EDTA对酶的抑制作用不明显,表面活性剂SDS、聚乙二醇辛基苯基醚、Tween80、巯基乙醇和碘乙酰胺对MmH的酶活有抑制作用。MmH对含酰胺键化合物如5-（甲基氨基）-5-氧-戊酸、敌稗、氯苯胺灵、2-氯-N-（2-甲基-6-乙基苯基）乙酰胺都有显著水解效果。