论文部分内容阅读
目的：探索细胞因子信号转导抑制因子-3 (Suppressor of cytokine signaling-3, SOCS-3)在慢性肝损伤肝组织中的表达,阐明其在慢性肝损伤中的作用。通过构建大鼠细胞因子信号转导抑制因子-3 (SOCS-3)基因的重组pcDNA3.1质粒,为进一步研究该基因在慢性肝损伤的作用提供技术平台。方法：1.清洁级雄性健康Wistar大鼠48只,设置模型组(36只)和对照组(12只)。模型组40%四氯化碳(Carbon tetrachloride, CCL4)花生油溶液皮下注射建立慢性肝损伤模型,对照组以同等条件注射花生油,于第4、6、8、10周收集血液和肝脏组织。2.肝脏组织SOCS-3 mRNA采用实时荧光RT-PCR检测。3.肝脏组织SOCS-3蛋白采用免疫组化SP法检测。4.肝功能ALT、AST检测,由泸州医学院附属医院检验科协助完成。5.血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)采用放射免疫法检测,由泸州医学院附属医院核医学科协助完成。6.肝脏病理检查：HE染色,显微镜下按Knodell HAI评分标准对肝脏炎症、肝纤维化进行评分。7.设计特异性引物,利用大鼠肝脏组织中提取的总RNA逆转录成cDNA,经PCR扩增出目的片段,采用限制性内切酶HindⅢ和Bam HⅠ双酶切质粒pcDNA3.1,得到的SOCS-3基因片段与已切的载体pcDNA3.1,根据摩尔比3：1连接并转化感受态大肠杆菌DH5-a,后长出的克隆仍采取双酶切鉴定,阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。8.统计学方法：数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS 16.0统计学软件分析数据,模型组和对照组采用独立样本t(Independent-Samples T Test)检验,模型组与组之间采用单因素方差分析(One way ANOVA)。结果：1.模型组4周时肝功能无明显异常,肝组织有轻微炎症表现,但很少有肝纤维化出现,6、8、10周时肝功能明显异常,肝脏炎症较前明显加重,肝纤维化程度加重,至10周时均有肝硬化表现,而对照组肝脏组织无明显炎症表现,也无纤维化表现。‘2.慢性肝损伤模型组SOCS-3 mRNA相对表达量随肝损伤程度加重而逐渐增加,模型组4周时为2.13±0.79,6周时为3.42±0.49,8周时为4.24±0.48,10周时为6.09±1.08,而对照组4周时为0.62±0.34,6周时为0.71±0.30,8周时为0.71±0.31,10周时为0.83±0.24,模型组SOCS-3 mRNA相对表达量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组第4、6、8、10周与周间比较,SOCS-3 mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05)。3.免疫组化检测肝脏组织SOCS-3蛋白表达,显示阳性染色呈棕黄色,表达主要集中在细胞浆。对照组SOCS-3蛋白表达很少,与对照组比较,模型组SOCS-3蛋白表达明显增强。通过对各组SOCS-3蛋白平均光密度值分析,显示对照组和模型组在4、6、8、10周组间两两比较,SOCS-3蛋白的相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05),对照组明显低于模型组；模型组在4、6、8、10周与周间比较,SOCS-3蛋白的相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05)。4. SOCS-3 mRNA和SOCS-3蛋白与ALT、AST、TNF-α、肝组织炎症及纤维化Knodell HAI评分相关性分析：在慢性肝损伤时,SOCS-3 mRNA和SOCS-3蛋白与ALT、AST、TNF-α、肝组织炎症及纤维化Knodell HAI评分呈正相关。5.构建大鼠细胞因子信号转导抑制因子-3 (SOCS-3)基因的重组pcDNA3.1质粒通过酶切证实大鼠SOCS-3基因被成功的克隆到质粒pcDNA3.1载体中,测序结果证明重组质粒载体的插入序列与设计的靶基因序列一致。结论：1.在慢性肝损伤中,随着肝脏损伤加重,受到炎症因子持续刺激,SOCS-3 mRNA及其蛋白表达逐渐增加,其表达与炎症和纤维化程度有关。2.成功构建大鼠SOCS-3基因的真核表达质粒重组体,为进一步研究该基因在慢性肝损伤的抑制调节作用提供技术平台。