Ⅱ型丙酮酸激酶的表达与功能研究

• 作 者: 赵龙
• 出 处: 合肥工业大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 丙酮酸激酶 丙酮酸 三磷酸腺苷 基因工程 ATP再生系统

三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)在医疗领域应用广泛,对肝炎、脑溢血后遗症、心肌疾患等多种疾病均具有良好疗效。但由于三磷酸腺苷酶法合成中酶的价格昂贵,未在工业上获得广泛应用。在生物体内外Mg2+的存在下,丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)能够催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的磷酸基团转移到二磷酸腺苷(ADP)上从而生成丙酮酸(PYR)和ATP。此步反应为ATP的酶法合成提供了新的思路;而且基于此步反应的ATP再生系统,采用再生ATP的廉价底物来替代ATP,可以有效提高有用物质生产过程的经济性。本研究利用DNAMAN、MEGA 7软件对Pyk A氨基酸序列进行分析发现,Pyk A中涉及构成ATP及PEP结合位点的氨基酸残基是高度保守的。然后进一步采用基因工程技术成功构建Ⅱ型丙酮酸激酶(PykA)的表达载体pET28a(+)-pykA,并实现了其在大肠杆菌BL21中的高效表达:1L菌液可以得到34mg的蛋白;利用镍柱对PykA进行纯化,并对纯化后的蛋白进行定量,浓度可达到2.3mg/mL。通过高效液相色谱技术(HPLC)对Pyk A催化功能进行检测,结果发现在30℃,pH为8.0的环境中,ADP和PEP的浓度比为1:1时,无论反应进行0.5h还是1h,0.05mg/mL的PykA都无法将ADP完全转化为ATP,ATP的积累对PykA催化ADP磷酸化反应具有抑制作用;当ADP和PEP的浓度比为1:2时,0.05mg/m L的Pyk A只需0.5h就可以将ADP完全转化为ATP。本研究的结果可以达到将丙酮酸激酶更好地应用于ATP再生系统,为ATP的酶法合成提供新的思路的目的。