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目的: 肝癌是我国三大恶性肿瘤之一，虽然其发病机制尚不明确，但Ras信号通路的激活或Ras基因的突变在肝癌中普遍存在。另外，cyclin D1的过表达导致细胞周期缩短、细胞过度增殖，是人类肝癌等多种原发性肿瘤的重要特征，也是肿瘤诊断和预后判断的重要分子标志物。Cyclin D1的表达主要受三个信号通路的调控:(1) ERK通过激活cyclin D1启动子的顺势作用元件AP-1或Ets促进其mRNA的表达;(2)转录因子NF-κB通过结合cyclin D1启动子上的GGG(G/A)NNYYCC序列促进cyclin D1的mRNA表达;(3) mTOR通过稳定cyclin D1的mRNA和蛋白提升其蛋白表达水平。但不同组织的肿瘤以及同一组织肿瘤的不同亚型及不同发展阶段的肿瘤细胞，调控cyclin D1表达的分子机制不同。特别是ERK、NF-κB和mTOR的协同作用模式尚有待深入阐明。本研究用H-ras12V肝癌转基因小鼠和人Hep3B肝癌细胞株探究ERK、NF-κB和mTOR在调控cyclin D1表达中的主导作用及相互协同关系，为cyclin D1表达调控模式的深入研究提供基础数据。 方法: 1.体内实验 对病理证实的H-ras12V转基因雄鼠肝肿瘤组织、肿瘤周围组织以及非转基因雄鼠肝组织进行总RNA及蛋白质的提取。应用RT-qPCR和Westem blot方法检测cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平。用Western blot方法检测细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、NF-κB抑制蛋白α亚基(IκBα)的蛋白水平。 2.体外实验 提取人正常肝细胞LO2和肝癌细胞Hep3B的总RNA和蛋白质，RT-qPCR和Western blot法检测cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平。Western blot方法检测ERK1/2、p-ERK1/2 p-mTOR、IκBα的蛋白水平。用ERK、mTOR、NF-κB抑制剂处理Hep3B细胞，检测cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平。 结果: 1.体内实验 (1)病理检测结果表明:Ras癌基因诱导了转基因小鼠的多发性肝肿瘤，肿瘤体积大，典型的直径在5mm以上;病理切片显示肝肿瘤细胞呈小梁状生长排列，肝细胞癌变化明显，肝区的病灶有不典型肝细胞聚集，胞浆嗜碱性，胞核浓染，含有高度未分化细胞并伴有坏死，肿瘤周围损伤的肝细胞成扁平状。肿瘤周围组织与正常小鼠的肝组织没有明显的病理学变化。没有肝纤维化和肝硬化的病理特征。肝肿瘤组织与肿瘤周围组织分界清晰。 (2) cyclin D1表达水平的检测结果表明:RT-qPCR和Western blot结果显示，与非转基因小鼠肝组织、H-ras12V转基因小鼠的肝肿瘤周围组织相比，转基因小鼠肝肿瘤组织中cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平显著增高（P＜0.05）;非转基因小鼠肝组织与肿瘤周围组织中cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平无显著变化。 (3)信号通路检测结果表明:与非转基因小鼠肝组织、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织相比，肝肿瘤组织中ERK和p-ERK的蛋白水平都显著升高(P＜0.05)。与非转基因小鼠肝组织相比，H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织中ERK的蛋白水平没有显著变化，p-ERK的蛋白水平显著升高(P＜0.05)。与非转基因小鼠肝组织、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤周围组织相比，肝肿瘤组织中p-mTOR的水平显著升高(P＜0.05)，IκBα的蛋白水平显著降低（P＜0.05）。肿瘤周围组织与非转基因小鼠组织相比，p-mTOR和IκBα的蛋白水平没有显著变化。 2.体外实验 (1) cyclin D1表达水平的检测结果表明:人肝癌Hep3B细胞cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平分别是人正常LO2肝细胞的115.73和22.60倍(P＜0.001)。 (2)信号通路检测结果表明:与LO2相比，Hep3B细胞p-ERK1、ERK1、p-mTOR的蛋白水平分别升高10.87、24.77和20.60倍(P＜0.05)，IκBα的蛋白水平没有显著差异。 (3)抑制剂处理实验结果表明:与Hep3B细胞相比，ERK抑制剂PD184352处理Hep3B细胞对p-mTOR蛋白水平没有明显影响，但cyclin D1的mRNA表达水平显著下降(P＜0.001)，其蛋白表达水平也随之在6-24h明显降低;mTOR抑制剂Rapamycin处理Hep3B细胞显著提升了p-ERK的蛋白水平和cyclin D1的mRNA表达水平(P＜0.001)，但cyclin D1的蛋白表达水平在6-24h明显降低;同时用ERK和mTOR的抑制剂处理Hep3B细胞，与ERK抑制剂的处理结果相同;NF-κB抑制剂BAY11-7082处理Hep3B细胞对cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平没有明显影响。 结论: 1.体内研究表明，在Ras癌基因诱导的肝肿瘤发生过程中，MAPK/ERK、NF-κB和mTOR信号通路的激活可能是促进cyclin D1在肝肿瘤细胞中的过表达的主因，但它们之间的协同关系还需进一步研究。 2.体外研究表明，在人Hep3B肝癌细胞中，cyclin D1的表达水平主要受ERK和mTOR的调节，特别是，mTOR对ERK活性的抑制作用可能是有效维持Hep3B细胞高cyclin D1蛋白水平的重要调控机制。