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FAM96B(familywithsequencesimilarity96,memberB),又名MIP18,CGI-128。该基因定位于染色体上16q22.1-q22.3,其蛋白含有163个氨基酸,分子量为18kd,该蛋白质高度保守。目前有关FAM96B功能研究的报道较少,其功能尚未完全阐明。TanakaK研究小组报道了FAM96B和MMS19、Ciao1、XPD等组成一个大分子复合物MMXD,能够调节TFⅡH的活性,进而调控细胞的有丝分裂以及DNA损伤的修复。如果沉默FAM96B的表达则导致有丝分裂时形成多极纺锤体,最后形成异常的多核细胞。WeiwenYang等报道FAM96B能够调控E2-2蛋白的表达,进而在血管内皮细胞增殖、迁移和微管形成中发挥作用。从上述材料来看,FAM96B可能在细胞的生长、有丝分裂、肿瘤的发生发展、细胞凋亡中发挥重要的作用。 Apoptin是由鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)编码产生的一种小分子蛋白,含有121个氨基酸。它仅诱导具有致瘤表型细胞或转化表型细胞的凋亡,而对人正常细胞不产生凋亡效应。其细胞核定位是Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡的关键因素之一。 实验室前期研究发现FAM96B能与Apoptin相互作用,并经免疫共沉淀证实了二者在肿瘤细胞和正常细胞中均存在这种相互作用。 目的： 1.探讨FAM96B一级结构上影响其与Apoptin相互作用的肽段。 2.探讨FAM96B一级结构上能影响Apoptin亚细胞定位的肽段。 通过研究FAM96B结构与功能的关系,为FAM96B的功能研究提供新的资料,为Apoptin的诱导凋亡机制研究提供新的线索和思路。 方法： 采用分子克隆技术,构建带有myc标签的FAM96B缺失重组真核表达载体,分别为pcDNA3.1-myc-FAM96B△1(缺失的氨基酸序列为1-42)、pcDNA3.1-myc-FAM96B△2(缺失的氨基酸序列为43-121)、pcDNA3.1-myc-FAM96B△3(缺失的氨基酸序列为122-163),用他们分别与pcDNA3.1-flag-Apoptin质粒共转染HEK293T细胞,然后提取细胞总蛋白,通过免疫共沉淀检测FAM96B及其各个缺失重组体是否与Apoptin在HEK293T细胞中发生相互作用。通过免疫荧光技术,检测FAM96B及其缺失重组体对Apoptin在HEK293T细胞中定位的影响。 结果： 本研究成功构建了三个FAM96B的缺失重组体。将其各自单独转染或与pcDNA3.1-flag-Apoptin质粒共转染HEK293T细胞中后,均能够成功表达。将FAM96B及各个缺失重组体分别与pcDNA3.1-flag-Apoptin质粒共转染HEK293T细胞中后提取细胞总蛋白进行免疫共沉淀,结果表明全长的FAM96B、FAM96B△1和FAM96B△3与Apoptin在HEK293T细胞中均存在相互作用,FAM96B△2与Apoptin在HEK293T细胞中不能相互作用。将FAM96B及各个缺失重组体分别与Apoptin共转染HEK293T细胞中后进行免疫荧光实验,结果表明全长的FAM96B、FAM96B△1能使原本应该定位于细胞核的Apoptin重新定位于细胞质,而FAM96B△2、FAM96B△3不存在上述作用。 结论： 1.在HEK293T细胞中,全长的FAM96B、FAM96B△1和FAM96B△3与Apoptin存在直接的相互作用,FAM96B△2与Apoptin不存在直接的相互作用。说明FAM96B△2缺失的区域是FAM96B与Apoptin直接相互作用的关键区域,对应的氨基酸序列范围为43-121,该区域在FAM96B与Apoptin相互作用的时候发挥重要功能,缺失该区域后FAM96B与Apoptin不能直接相互作用。 2.全长的FAM96B、FAM96B△1能使原本应该定位于细胞核的Apoptin重新定位于细胞质,而FAM96B△2、FAM96B△3不存在上述作用。说明FAM96B△2、FAM96B△3缺失的区域都是影响Apoptin核定位的关键区域,缺失两个区域中的任何一个将使FAM96B不再对Apoptin的亚细胞定位产生影响。