海马齿磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆及功能分析

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海马齿(Sesuvium portulacastrum)又名滨水菜,是一种生长繁殖快,对盐碱、干旱和重金属离子具有高度耐受性的多年生红树林伴生植物,多生长于海边沙地及河流入海口两岸滩涂地带,可以在海水浇灌下正常生长,驯化后也能在淡水中生长。为解析海马齿耐盐碱的生理机制和分子基础,我们成功构建了海水诱导下根系差异表达基因的差减文库。在文库中筛选中,发现了一个与植物PHGPx具有高度同源性的EST。以此为基础,本研究检测了海马齿PHGPx酶活性与盐胁迫、H2O2胁迫之间的关系,成功克隆了海马齿PHGPx基因全长cDNA,获得了较为完整的分子信息,同时对其器官表达特异性、盐和H2O2胁迫与基因表达的相关性进行了研究。主要结果如下:1、测定了NaCl和H2O2胁迫条件下,海马齿叶片中的PHGPx酶活性与NaCl和H2O2剂量的相关性。研究结果表明,海马齿叶片PHGPx酶活性与NaCl和H2O2剂量呈正向关;在内源过氧化氢被清除的情况下,NaCl依然能够刺激SpPHGPx酶活升高,而H2O2却不起作用。推测海马齿盐胁迫的信号传导,可能与非依赖H2O2的抗氧化防御途径有关。2、以筛选获得的SpSSH 713 EST序列为基础,利用RACE技术从海马齿根中成功克隆了编码磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的基因,命名为SpPHGPx (GenBank登录号:GU479913)。该基因cDNA全长为821bp,含有一个513bp的开放阅读框,编码170个氨基酸;预测的SpPHGPx分子量为18.78kDa,等电点为7.62。推导的氨基酸序列与冰叶日中花(Mesembryanthemum crystallinum,AAB61592)、菠菜(Spinacia oleracea, CAA46649)、蓖麻(Ricinus communis,XP-002509790)和杨树(Populus trichocarpa, XP002299536)相应的PHGPx的同源性分别为86%、87%、89%和85%。生物信息学分析表明,SpPHGPx含有真核生物磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶所特有的3个保守的亚结构域,N端没有明显的信号肽,是一个非跨膜的亲水性稳定蛋白。3、利用半定量RT-PCR检测了SpPHGPx结的表达特征。结果显示:SpPHGPx呈组成型表达,但叶中的表达量明显高于根和茎;非生物刺激,如海水、NaCl和H2O2均能诱导其表达量显著增加。4、成功构建原核表达载体pET-30a-SpPHGPx,获得了特异表达蛋白;成功构建植物表达载体pCAMBIA1304-SpPHGPx,通过农杆菌介导的叶盘转化法获得了22株转基因烟草植株。结论:1、盐胁迫可以提高海马齿PHGPx酶活性,海马齿PHGPx参与了对盐胁迫的响应;内源过氧化氢清除试验表明,海马齿盐胁迫的信号传导可能与非依赖H2O2的抗氧化防御途径有关。2、编码海马齿磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的基因SpPHGPx在海马齿中呈组成型表达,但叶中的表达量明显高于根和茎;海水、NaCl和H2O2处理均能诱导其表达。
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