论文部分内容阅读
玉米在种植面积和产量上已成为我国第一大粮食作物，不仅是主要的粮食和饲料来源，而且是重要的工业原料，对我国粮食和经济安全发挥着重要的保障作用。虽然近几年我国玉米产量增长较快，但平均单位面积产量仅为美国的60％，说明我国玉米单产还有巨大的提高潜力和空间。株型，穗/粒型和抗逆性构成了玉米产量的关键性状，同时也是制约玉米产量提高的主要因素，全面揭示控制这些重要性状的基因及其形成的复杂调控网络，对提高玉米产量具有重要意义。本实验室一直致力于研究玉米ROS介导的玉米抗逆和籽粒发育调控网络，并克隆了相关基因。为了进一步鉴定更多的ROS介导的玉米抗逆和发育基因，本论文以玉米叶、根和籽粒为材料，利用phi29聚合酶介导的滚环扩增，玉米叶肉原生质体转化，农杆菌介导的玉米幼胚转化，荧光强度比值分析和荧光定量PCR等方法，建立了玉米全基因组均一化长片段RNAi文库和基于roGFP1的细胞氧化还原状态变化感应系统。 本论文工作取得的主要研究结果如下: 以PEG6000模拟干旱处理的三叶期玉米叶片为材料，构建了玉米叶均一化cDNA文库，库容量1.25×106cfu，平均插入片段为1.5kb;通过滚环扩增将其转换为均一化RNAi文库，库容量3×106cfu，平均插入片段为3kb，随机挑取的1000个克隆的测序和功能分析表明:700个不同基因均匀分布于玉米染色体组上，具有细胞组分，转录调控和响应刺激等多种生物学功能，并参与了代谢和信号转导等通路。同时，通过实时荧光定量PCR初步表明了ihRNA发挥了基因沉默效应。 以PEG6000模拟干旱处理的三叶期玉米根为材料，构建了玉米根均一化cDNA文库，库容量1.25×106cfu，平均插入片段为1.5kb;通过滚环扩增将其转换为均一化RNAi文库，库容量3×104cfu，平均插入片段为3kb，随机挑取的500个克隆的测序和功能分析表明:300个不同基因均匀分布于玉米染色体组上，具有催化，结合等多种生物学功能，并参与了TCA循环等代谢通路。 以玉米籽粒为材料，构建了玉米籽粒均一化cDNA文库，其平均插入片段为1kb;通过滚环扩增将其转换为均一化RNAi文库，平均插入片段为2kb。 在玉米叶肉细胞瞬时表达系统中，成功的建立了roGFP1探针响应外源H2O2和DTT的加入、内源基因APX表达水平的改变及外源和内源因素同时引起的玉米体内氧化还原状态改变的感应系统。同时，对玉米APX家族的基因做了全面的进化树分析，表明玉米APX具有清除ROS的能力;通过实时荧光定量PCR表明了这10个玉米APX基因均不同程度的响应了激素ABA、旱胁迫和盐胁迫的诱导，并有效调节玉米体内ROS水平和氧化还原状态，适合用作检测roGFP1感应由内源抗逆相关基因表达水平改变引起的细胞氧化还原状态改变的标准基因。 本研究的结果为玉米全基因组突变体库创制和品种遗传改良提供了玉米叶、根和籽粒组织的长片段均一化RNAi文库，并为规模化鉴定ROS介导的玉米抗逆和发育调控网络的基因提供了筛选系统。