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狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）引起的一种人兽共患传染病，在全球范围内流行，以急性、渐进性和致死性脑炎为特征。狂犬病是目前病死率最高的传染病之一，一旦出现神经症状病死率几乎高达100%。全球每年死于狂犬病的人数高达55,000，主要发生在非洲和亚洲的发展中国家。近年来，我国狂犬病疫情呈现了快速回升的趋势，每年造成的死亡人数均在2,000以上，已经成为一个严重的公共卫生问题。据统计，99%以上人间狂犬病死亡病例因狂犬病犬咬伤所致。对于人间狂犬病的控制，最有效的措施是通过疫苗接种从源头上控制犬狂犬病。传统的狂犬病弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患；灭活疫苗安全、有效，但成本昂贵。因此，研制安全、有效，成本低廉的动物狂犬病疫苗，仍具现实意义。反向遗传技术的发展与成熟使得不分节段的单股负链RNA病毒作为疫苗载体成为可能。犬瘟热（Canine distemper, CD）是由副粘病毒科的犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的犬、貂和狐狸等肉食动物的一种重要传染病，在全球广泛分布，严重影响着养犬业及经济动物养殖业的健康发展。弱毒疫苗接种能有效预防该病，应用广泛。利用CD弱毒疫苗株为载体，构建重组二联活疫苗，可实现一苗两防，有利于提高狂犬病免疫覆盖率，提高免疫质量，节省狂犬病免疫的经济成本。为此，本研究以我国生产中应用的CD弱毒疫苗株CDV/R-20/8为亲本毒株，建立了该毒株的反向遗传操作系统。救获的犬瘟热弱毒疫苗株rCDV保持了野生型CDV/R-20/8的细胞培养生长特性，二者在Vero细胞上的多步生长曲线基本一致，生长滴度在相同的时间内达到峰值，最高生长滴度均为1×106.5TCID50/mL。为评估CDV作为活病毒载体表达外源蛋白基因的潜力，构建了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组犬瘟热病毒rCDV-EGFP。重组病毒rCDV-EGFP在Vero细胞上的生长特性与亲本株rCDV相似，最高生长滴度可达1×106.5TCID50/mL。该重组病毒具有良好的Vero细胞生长适应性及遗传稳定性，在Vero细胞上连续传代10代次后，仍能稳定、高效的表达EGFP。结果表明，CDV疫苗株CDV/R-20/8具有作为活病毒疫苗载体的潜力，为研制防制狂犬病和犬瘟热的重组二联活载体疫苗奠定了基础。在此基础上，进一步构建了表达RV弱毒疫苗株ERA G蛋白的重组犬瘟热弱毒疫苗株rCDV-RVG。该重组CDV保持了亲本毒株rCDV对Vero细胞的良好适应性和稳定性，可达到高水平的生长滴度，最高生长滴度可达1×106.25TCID50/mL。rCDV-RVG和rCDV按3×104TCID50/30μL/只和1×105TCID50/100μL/只的剂量，分别经脑内和肌肉注射途径接种小鼠，观察3周，所有接种小鼠未见任何明显的狂犬病症状；rCDV-RVG和rCDV无论肌肉接种小鼠，还是脑内接种小鼠，与相应的PBS接种对照小鼠相比，观察期间的体重变化均无显著性差异。结果表明，RV G蛋白基因的插入、表达并没有增强疫苗载体CDV对小鼠的致病力。同时，rCDV-RVG按1×105TCID50/100μL/只的剂量经肌肉注射途径接种小鼠，可诱导显著的RV中和抗体反应。免疫后3周应用致死剂量的RV街毒GX/09株进行攻击。结果免疫小鼠全部获得保护，而对照小鼠全部发病死亡。结果表明，rCDV-RVG对小鼠具有的良好的生物安全性和的免疫原性。为进一步评估重组病毒对犬的免疫原性，rCDV-RVG和rCDV分别按1×106TCID50/1mL/只的剂量，经肌肉注射途径接种3月龄比格犬5只，初次免疫后3周以相同剂量、途径加强免疫一次。免疫后持续观察，定期检测免疫犬血清中CDV和RV中和抗体。结果rCDV-RVG初次免疫后1周和3周，免疫犬血清中的RV中和抗体滴度平均值分别为1.48IU和32.11IU。第二次免疫后2周，RV中和抗体反应显著增强，其平均值可达96.71IU。rCDV-RVG诱导的RV中和抗体反应可持续一年以上，初次免疫后70周，免疫犬血清中的RV中和抗体滴度平均值仍>0.5IU，即保护动物抵抗致死剂量RV街毒攻击的最小滴度。结果提示，重组病毒rCDV-RVG两次免疫接种，可为免疫犬提供1年以上的有效保护。免疫后70周进行第3次免疫，结果诱导更为显著的加强免疫反应，第3次免疫后1周，血清RV中和抗体滴度平均值升至281.4IU。与此同时，rCDV-RVG和rCDV初次免疫后3周，均诱导显著的CDV中和抗体反应，第二次免疫后CDV中和抗体水平迅速上升。一年后进行第3次免疫，二者均可诱导更加显著的加强免疫反应，而且rCDV-RVG诱导的CDV中和抗体滴度峰值与亲本株rCDV的相比无显著性差异。本研究结果表明，重组病毒rCDV-RVG具有良好的生物安全性和免疫原性，是一个有希望的新型狂犬病、犬瘟热重组二联活疫苗候选株。