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背景糖尿病(DM)严重威胁人类健康,它通常是由于胰岛素绝对不足(1型糖尿病),或胰岛素抵抗和相对缺乏(2型糖尿病),从而导致高血糖。糖尿病常伴有骨代谢障碍,往往导致骨质减少、骨质疏松或结构不良等骨病。另一方面,糖尿病还会干扰骨形成,增加患者骨折的风险并阻碍骨折的愈合。糖尿病患者颌骨可表现为骨质疏松、牙槽骨吸收和牙齿松动等症状。而当牙齿松动甚至脱落后,种植牙是目前修复缺失牙的一种重要治疗手段。然而,糖尿病环境所致颌骨异常骨生理和病理变化却是种植牙修复的一大难题。因此,研究糖尿病导致颌骨异常的机理并提出可能的干预手段,对口腔临床有着极大的指导意义。就其来源而言,颌骨与四肢骨骼不同:颌骨由胚胎的神经嵴发育而来,而四肢骨骼则来源于中胚层。针对颌骨BMSCs和胫骨BMSCs的研究表明,不同来源的BMSCs具有不同的生物学特性。来自上述两种来源的BMSCs在成骨和增殖能力方面存在差异,其中神经嵴来源的BMSCs的成骨能力更强。此外,颌骨和四肢骨具有不同的骨形成模式,颌骨主要通过膜内成骨,而胫骨等四肢骨则主要通过软骨内成骨而进行。目前,对糖尿病性骨病的研究主要集中在四肢骨骼来源的细胞或组织,而针对颌骨在糖尿病中病变机制的研究则较少。因此我们假设:在骨形成过程中,相关成骨基因的表达以及调节机制可能在这两个起源的骨组织中有所不同。微小RNA(miRNA/miR)是由约22个核苷酸组成的非编码单链RNA分子,广泛分布于所有类型的真核生物体中。通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-UTR)结合,miRNA可能影响其稳定性或翻译抑制,从而转录后调节基因的表达,调节生物体的生长、发展和疾病。多种miRNA在包括糖尿病在内的众多人类疾病中具有重要作用,并且在受影响的患者组织中异常表达。研究表明,某些miRNA在维持骨骼发育和代谢方面非常重要。它们通过调节成骨转录因子及其相关因子或调节成骨相关的信号通路来调节骨形成。尽管与成骨相关的许多因素和途径已被确定为受miRNA调控,但是很少有研究评估颌骨中的miRNA表达,因此,miRNA是否参与糖尿病牙槽骨的丧失和颌骨的骨质疏松仍然不清楚。目的筛选2型糖尿病和正常颌骨差异表达的miRNA,明确miRNA在调节2型糖尿病颌骨成骨中的作用,并探讨相应的机制。结果将有助于揭示糖尿病影响成骨的机制,为临床应用,改善糖尿病骨质疏松症提供有效的靶点。方法第一部分:采用实时荧光定量RT-PCR对糖尿病大鼠与正常大鼠颌骨成骨相关基因,包括ALP、OC、Runx2、Osterix、Smad1及Col1a1的mRNA的表达进行检测。利用ALP染色检测体外高糖与低糖环境培养条件下颌骨来源BMSCs在成骨诱导7天后ALP的活性。采用RT-qPCR对颌骨来源BMSCs在体外高糖与低糖培养条件下成骨诱导第0、3、6、9、12、15、18及21天的成骨相关基因ALP、OC、Runx2和Osterix的表达进行检测。采用Western blot对颌骨来源BMSCs在体外高糖与低糖培养条件下,成骨诱导第1、4、7、10、14及21天的成骨关键转录因子Runx2的蛋白表达水平进行检测。第二部分:采用小RNA高通量测序,检测实验性2型糖尿病与正常大鼠颌骨差异表达的miRNA。利用RT-qPCR对其中差异表达的miRNA加以验证。在此基础上利用Targetscan,miRanda和PITA预测miRNA的靶基因,并取交集。分析所得靶基因的功能,挑选与成骨相关的miRNA进行下一步研究。第三部分:分别将Agomir-203-3p,antagomir-203-3p,Agomir NC或antagomir NC转染入C3H10T1/2细胞或大鼠颌骨来源BMSCs。转染后成骨诱导第7天,进行ALP染色,检测ALP的活性。采用Western blot检测成骨诱导第4、7及14天时,Runx2的蛋白表达水平。采用RT-qPCR对成骨诱导第1、4、7及14天的成骨相关基因,包括ALP、OC、Runx2、Osterix的mRNA的表达进行检测。第四部分:使用Targetscan软件,在预测的候选靶基因Smad1的mRNA的3’-UTR中寻找到在脊椎动物中高度保守的miR-203-3p可能结合位点。将agomir-203-3p,antagomir-203-3p,agomir NC或antagomir NC分别转染入C3H10T1/2细胞或大鼠颌骨来源BMSCs,采用Western blot检测Smad1的蛋白表达。将agomir-203-3p或agomir NC转染入C3H10T1/2细胞或大鼠颌骨来源BMSCs,采用Western blot检测BMP/Smad信号通路相关蛋白Smad1和p-Smad1/5/8的水平;采用RT-qPCR检测Smad1的mRNA的表达。转染agomir-203-3p,antagomir-203-3p,agomir NC或antagomir NC后成骨诱导,采用Western blot检测成骨过程中Smad1的蛋白表达水平。将包含预测的Smad13’-UTR端miR-203-3p的可能结合位点或突变位点的荧光素酶报告质粒p GL3-Smad1-WT或p GL3-Smad1-mut,与ph RL-TK,和agomir-203-3p或agomir NC共转染。采用双荧光素酶报告基因检测分析miR-203-3p靶向结合Smad1 mRNA 3’-UTR端的预测的结合位点的情况。将Smad1过表达质粒或阴性对照,与agomir-203-3p或agomir NC转染入C3H10T1/2细胞,转染后进行成骨诱导7天,用RT-qPCR检测Runx2,Alp,Osterix和OC的mRNA表达水平,用ALP染色检测ALP的活性。结果第一部分:RT-qPCR检测结果显示在糖尿病大鼠下颌骨中成骨基因明显下调,这与已有四肢骨研究的结果一致。ALP染色结果表明高糖培养基较低糖培养基中成骨诱导的颌骨BMSCs的ALP活性下调。Western blot检测结果显示高糖培养较低糖培养的细胞中Runx2的蛋白表达在各时间点下调。RT-qPCR检测结果显示除在成骨诱导末期,Runx2和Alp的表达无明显表达差异外,在成骨过程中,成骨相关基因,包括ALP、OC、Runx2、Osterix的mRNA表达在高糖培养组各时间点均下调。这些结果表明糖尿病和高糖水平抑制了成骨。第二部分:小RNA高通量测序聚类分析热图表明23种miRNA在两组大鼠之间有不同的表达,在糖尿病大鼠颌骨中8种miRNA上调,15种miRNA下调。其中rno-miR-203a-3p,rno-miR-23a-3p,rno-miR-320-3p,rno-miR-1-3p,rno-miR-1b,rno-miR-872-5p,rno-miR-185-5p和rno-miR-345-5p上调,而rno-miR-30c-5p,rno-miR-96-5p,rno-miR-17-5p,rno-miR-148a-3p,rno-let-7b-5p,rno-miR-181a-5p,rno-miR-128-3p,rno-miR-199a-5p,rno-miR-181b-5p,rno-miR-200b-3p,rno-miR-142-3p,rno-miR-674-3p,rno-miR-149-5p,rno-miR-139-5p和rno-miR-375-3p下调。RT-qPCR验证高通量测序的结果与高通量测序的结果一致。利用Targetscan,miRanda和PITA预测miRNA的靶基因,发现miR-203a-3p可能靶向多个成骨相关基因,而其是否调节成骨在以往的研究中未见报道,初步确定其为进一步研究对象。第三部分:ALP染色结果显示agomir-203-3p降低了ALP的活性,而antagomir-203-3p则增强了ALP的活性。Runx2的蛋白表达在成骨过程中被agomir-203-3p抑制并且被antagomir-203-3p促进。RT-qPCR检测结果显示agomir-203-3p抑制了Runx2和ALP的表达,而antagomir-203-3p则促进了Runx2和ALP的表达。同样,Osterix和OC的表达被agomir-203-3p延迟,并被antagomir-203-3p促进。这些结果表明miR-203-3p对C3H10T1/2细胞和BMSC的成骨起抑制作用。第四部分:使用Targetscan软件,在预测的靶基因Smad1的mRNA的3’-UTR中寻找到在脊椎动物中广泛保守的miR-203-3p的可能结合位点CAUUUCA。Western blot结果显示Smad1的蛋白表达在转入agomir-203-3p之后被抑制,并且在转入antagomir-203-3p之后被促进。转入agomir-203-3p后显著抑制了Smad1和p-Smad1/5/8的蛋白水平。RT-qPCR结果显示agomir-203-3p使Smad1的mRNA表达被抑制。上述结果提示miR-203-3p通过影响Smad1的mRNA的稳定性来抑制其蛋白的表达。此外,成骨诱导过程中Western blot检测结果显示agomir-203-3p抑制或推迟了C3H10T1/2细胞和r BMSCs成骨过程中Smad1的表达,而抑制miR-203-3p则促进了Smad1的表达。双荧光素酶报告基因检测结果显示与agomir-NC组相比,agomir-203-3p组中p GL3-Smad1载体的荧光素酶活性下降(P<0.01),而agomir-203-3p对p GL3-Smad1 mut载体的荧光素酶活性没有影响。这些结果与生物信息学预测一致,即Smad1 mRNA的3’-UTR的预测结合位点是miR-203-3p的直接靶标。RT-qPCR及ALP染色结果显示Smad1的异位过表达减弱了miR-203-3p介导的成骨分化的抑制,表明miR 203-3p抑制成骨分化的作用,部分是通过下调Smad1的表达而达成的。结论miR-203-3p在糖尿病大鼠颌骨成骨过程中起抑制作用,且在糖尿病大鼠下颌骨或高糖培养的细胞中呈高表达。Smad1是成骨信号通路BMP/Smad通路中的重要信号传导蛋白,miR-203-3p通过靶向结合Smad1,抑制其转录后表达,继而影响BMP/Smad信号通路的传导,这可能是miR-203-3p在糖尿病环境下抑制成骨的相关机制。