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目的:阻断大鼠双侧椎动脉和双侧颈总动脉造成全脑缺血,开放血管后造成再灌注损伤,经鼻咽腔实施冷盐水灌注来降低大脑深部温度,实现头部的浅低温,通过检测缺血再灌损伤后大鼠海马细胞线粒体膜电位的变化,以及观察海马CA1区Bcl-2,Bax蛋白,细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)蛋白和Pro-Caspase-3蛋白的表达,来探究线粒体膜电位变化与细胞凋亡的关系,以及头部浅低温减少缺血再灌注损伤的理论基础。方法:1实验动物分组36只清结级成年Wistart大鼠,均为雄性,体重250~280g。随机分成3组,每组12只,标记为假手术组即S组,缺血再灌注组即I/R组,头部浅低温缺血再灌注组即HI/R组。2实验模型的建立以及头部浅低温的实施基于大鼠全脑四血管供血的解剖学基础[1,3],永久性闭塞双侧椎动脉后,夹闭双侧颈总动脉造成全脑缺血,开放动脉夹复灌制造缺血再灌注损伤模型,经鼻咽降温实现头部浅低温。大鼠禁食大于8小时,记录体重,腹腔注射水合氯醛麻醉,待其对针尖刺激无反应后俯卧固定,在颅骨下触及第一颈椎,沿中线切开分离组织直至脊椎骨,暴露椎旁两侧翼小孔,用电烧尖烧闭双侧椎动脉,检验无出血后逐层缝合。观察24h再次麻醉大鼠,仰卧固定,插入气管导管,持续吸入七氟醚,经鼠颈分离双侧粗大颈总动脉,准备动脉夹。S组大鼠仅分离出双侧翼小孔和颈总动脉,不予其它处理。I/R组,HI/R组均烧灼翼小孔闭塞椎动脉,夹闭双侧颈总动脉15min,开放灌注24小时。其中HI/R组在气管插管后于鼻腔置入管路,灌注4℃晶体液降低脑温,待海马区温度达33℃时进行双侧颈总动脉夹闭,开放动脉复灌1小时后停止降温,自然复温。3.实验样本提取及检测方法3.1 JC-1 荧光法显微镜下观察大鼠海马细胞线粒体膜电位变化每组取大鼠4只,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后迅速断头,取出大脑放于冰盘上分离海马组织,标本参照线粒体提取试剂盒使用方法提取线粒体,操作过程于低温环境下进行,标本用于线粒体膜电位的观察。3.2 Western Blot法测定Caspase-3酶原每组取再灌注24小时大鼠4只,10%水合氯醛进行麻醉,于鼠颈根部断头,低温下分取鼠脑海马组织,置于冷冻管密封,在液氮罐中快速超低温冰冻标本,再转移到-80℃冰箱长时间保存。标本用Western Blot方法测定Caspase-3酶原表达。3.3免疫组化法观察海马CA1区Cyt C蛋白,Bcl-2及Bax蛋白表达每组取大鼠4只麻醉,剪开胸廓于心尖处插入细针,以0.9%氯化钠灌注清洗血管,再以4%多聚甲醛溶液灌流固定,待大鼠全身僵直后即刻断头取脑分离海马组织,标本放入4%多聚甲醛溶液中继续固定,4℃保存,用免疫组化法观察Cyt C蛋白,Bcl-2蛋白及Bax蛋白。结果:1大鼠海马CA1区Caspase-3酶原表达相比于S组,I/R组Caspase-3酶原蛋白量减少,HI/R组Caspase-3酶原蛋白量减少,差异显著,有统计学意义(P<0.05);相比于I/R组,HI/R组Caspase-3酶原蛋白量增加,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。2大鼠海马CA1区Cyt C蛋白表达相比于S组,I/R组,HI/R组Cyt C蛋白表达均明显增加,有统计学差异(P<0.05);相比于I/R组,HI/R组Cyt C蛋白表达明显减少,有统计学差异(P<0.05)。3大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax蛋白表达相比于S组,I/R组,HI/R组Bcl-2蛋白,Bax蛋白表达均明显增加,有统计学差异(P<0.05);相比于I/R组,HI/R组Bcl-2蛋白表达明显增加,Bax蛋白表达明显减少,两者均有统计学差异(P<0.05)。4大鼠海马CA1区细胞线粒体膜电位的观察S组在JC-1荧光滤片上观察为高红高绿(绿++红++),染料聚集明显,是膜电位正常时的荧光图像;与S组比较,I/R组明显表现为低红高绿(绿++红),红色荧光下仅有极少量染料聚集呈现亮红色,反映膜电位明显下降;与S组比较,HI/R组表现为中红高绿(绿++红+),红色荧光下看到较3实验样本提取及检测方法3.1 JC-1荧光法显微镜下观察大鼠海马细胞线粒体膜电位变化多染料聚集,反映膜电位下降。与I/R组比较,HI/R组红绿荧光图像差异不明显,反映膜电位下降少于I/R组。结论:1头部浅低温可影响大鼠全脑缺血再灌注损伤后海马细胞线粒体膜电位以及细胞凋亡;线粒体膜电位的变化与细胞凋亡密切相关。2头部浅低温可降低大鼠全脑缺血再灌注损伤,具有神经保护作用。