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茶叶中含有大量的多酚类物质,如黄酮、黄烷酮、黄酮醇和黄烷-3-醇(儿茶素)。多酚类物质具有强力的自由基清除功能和抗氧化功效。长期饮茶有助于预防癌症、抗心血管疾病、抗炎症和抗过敏等。由于人们对茶需求的日益提高,茶树多酚类物质生物合成的研究成为国内外研究的热点。本实验利用二代高通量测序技术,对蔗糖处理的茶样进行RNA-Seq,lncRNASeq、sRNA-Seq和降解组测序分析,并从中筛选鉴定出参与茶树多酚类化合物生物合成及调控的相关基因。具体研究结果如下:1.首先优化了糖处理的方式,最终选择蔗糖处理9h后的一叶样品为测序材料。基于Illumina HiSeq测序平台,对蔗糖处理的茶样进行RNA-Seq测序分析。测序结果显示,类黄酮代谢途径的大多数结构基因受到蔗糖处理的诱导而上调;促进类黄酮生物合成代谢的第五亚族MYB转录因子均受到蔗糖处理的诱导而上调,而抑制类黄酮生物合成代谢的第四亚族MYB转录因子全部下调。特别是,CsMYB5a和CsMYB5b以及靶基因CsLAR和CsANR被蔗糖处理诱导而显著上调,说明蔗糖处理能够促进类黄酮代谢途径流向儿茶素和原花青素合成的方向。2.基于Illumina HiSeq测序平台,对蔗糖处理的茶样进行lncRNA-Seq测序分析。测序结果显示,达到显著差异的lncRNA基因有2950个,显著差异的lncRNA转录本3224个。通过靶基因预测,我们发现CsF3’5’Hb、CsCHIc、CsDHQS、CsSK1基因和CsMYB、CsbHLH转录因子是一些lncRNA的靶基因。3.基于Illumina HiSeq测序平台,对蔗糖处理的茶样进行sRNA-Seq和降解组测序分析。测序结果显示,得到26个差异表达的miRNA,其中有14个miRNA表达上调,12个miRNA表达下调。一些miRNA被预测调控儿茶素生物合成途径的基因,如CsC4Hb、Cs4CLc、CsCHIa和CsLARb;一些miRNA被预测调控莽草酸代谢途径的结构基因包括Cs CS1;还有一些miRNA被预测调控转录因子如CsMYB5a、CsMYB5c和一个CsbHLH。推测miRNA可能通过负调控CsMYB5a和CsMYB5c的表达间接调控儿茶素或PA的合成。4.本研究中,克隆了三条microRNA(miR156,miR166和miR396b)的前体序列,并分别将它们过表达在拟南芥中。miR156过表达的拟南芥植株表现出植株矮小、叶子数目明显增加、而花和果荚的数目明显减少的症状;miR396b过表达的拟南芥植株表现出矮小的性状。在NaCl和甘露醇胁迫处理下,miR156转基因拟南芥植株的根明显比WT的长,且甘露醇处理下,转基因植株的侧根更多更发达,表明miR156可能有利于增强茶树的抗盐抗旱能力。5.本实验从茶树中克隆了两条F3H基因,即CsF3Ha和CsF3Hb。酶活分析表明,两个重组的CsF3H酶都能将底物柚皮素和圣草酚转化成二氢山奈酚和二氢槲皮素。表达图谱显示,两条CsF3H基因都是在茶树嫩稍中高表达,且都能被紫外、蔗糖和ABA处理诱导而上调。在CsF3Ha和CsF3Hb转基因拟南芥种子中,大部分黄酮醇糖苷和寡聚原花青素含量显著增加,然而单体儿茶素衍生物含量减少了。