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研究背景与目的前列腺癌是男性泌尿、生殖系统常见的恶性肿瘤之一,我国近年来前列腺癌发病率呈上升趋势。雄激素阻断疗法(ADT)是目前临床治疗前列腺癌及其转移癌的重要手段,但几乎所有阻断雄激素治疗的患者最终都发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC), ADT不敏感且预后较差。前列腺凋亡反应基因4(par-4)是一种促凋亡基因,其选择性癌细胞凋亡结构域SAC能在不依赖凋亡刺激的情况下,同时诱导雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌细胞凋亡,而不损害正常细胞,表现出良好的肿瘤靶向杀伤效应。腺相关病毒(AAV)具有免疫原性低、安全性好、没有炎性反应、可同时转染分裂和非分裂细胞及长期稳定表达目的基因等优点,在基因治疗载体研究中受到广泛关注。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)是由胚龄4-5d鸡胚的绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成,胚龄6-7d后CAM及其血管覆盖整个卵黄囊表面,且随着胚龄的增加而增大,毛细血管极其丰富,CAM是天然免疫缺陷宿主,可耐受一定的温度变化,适于移植性肿瘤的生长和生物学行为观测,常作为移植性肿瘤的实验模型。基于SAC对前列腺癌细胞的凋亡诱导机制及应用AAV载体,我们在前期研究中成功构建引入了真核信号肽神经营养素4(NT4)和穿膜肽HIV-1反式激活蛋白(TAT)的SAC基因重组腺相关病毒载体rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT,本研究旨在建立前列腺癌的CAM移植瘤模型,并将表达分泌SAC融合肽的重组腺相关病毒作用于移植瘤,观察其表达产物SAC融合肽对前列腺癌CAM移植瘤的抑制作用。材料与方法1.将前列腺癌细胞株PC-3细胞进行复苏和培养,收集对数生长期细胞,离心并用PBS缓冲液调整细胞浓度为5-8×106个/20μL。取孵育9d健康种鸡卵,酒精擦拭卵壳消毒,气室端开窗,撕去内壳膜暴露绒毛尿囊膜,然后将调整好浓度的PC-3细胞接种到鸡胚绒毛尿囊膜上,透明胶带封闭窗口继续孵育。密切观察移植瘤的生长及诱导血管生成情况。2.接种后第3天,选取成瘤较好(瘤直径≥3mm)且生长良好的鸡胚,随机分为3组,每组8只,给予下述不同处理,即空白对照组(PBS组：PBS,100μL/只)、空病毒组(AAV组：AAV,1×109cfu/100μL/只)、重组病毒组(rAAV组：rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT,1×109cfu/100μL/只)。在无菌超净台内按上述设计将相应试剂滴于移植瘤上,透明胶布封窗,继续37℃、60%-70%湿度温箱孵育。观察移植瘤生长情况,处理4d后测量各组移植瘤的大小,并完整剥离肿瘤,石蜡包埋、切片,免疫荧光法检测目的基因表达,根据瘤体积及HE染色比较各组作用效果。结果1.癌细胞接种于CAM后呈弥散样分布,接种24h后可见接种区CAM粗糙变厚,边界清楚。2d后接种区可见明显白色瘤团,但瘤周围毛细血管聚集尚不明显。3d后瘤体进一步增大,呈团状生长,可见少量毛细血管聚集。2.给予处理后PBS组及AAV组移植瘤继续生长,可见毛细血管环形聚集,以瘤体为中心呈弥漫、放射状分布。rAAV组移植瘤生长情况总体观察明显小于对照组。对3组移植瘤体积测量数据进行统计分析显示：PBS组、AAV组分别与rAAV组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；AAV组与PBS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光实验证实SAC融合肽表达。HE染色镜下见PBS组、AAV组移植瘤生长状态相似,瘤细胞呈条索状浸润生长,同时伴有新生血管形成,表现出高度侵袭能力；rAAV组移植瘤受到明显生长抑制,瘤细胞孤立成团,边界清晰,失去浸润生长和播散能力。结论1.成功建立前列腺癌CAM移植瘤模型。2.重组腺相关病毒rAAV-NT4-SAC-HA2-TAT感染移植瘤后表达分泌的SAC融合肽对CAM移植瘤的PC-3细胞产生了凋亡诱导作用,抑制了移植瘤的生长扩散,为SAC融合肽应用于前列腺癌尤其是激素非依赖性前列腺癌的基因治疗奠定基础。