【摘 要】
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急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是当今世界人民的主要死因之一,由于个人临床差异大、症状不明显,AMI早期的分子标志物成为学者们研究的重点。miRNA-208a作为AMI发作后0-3 h内由心肌受损细胞释放的外泌体内含物之一,具有心肌特异性强、丰度高、更早期等作为分子标志物的优点,因此有望应用于临床或现场即时诊断检测AMI。在本论文中,制备并优化设计了一
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急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是当今世界人民的主要死因之一,由于个人临床差异大、症状不明显,AMI早期的分子标志物成为学者们研究的重点。miRNA-208a作为AMI发作后0-3 h内由心肌受损细胞释放的外泌体内含物之一,具有心肌特异性强、丰度高、更早期等作为分子标志物的优点,因此有望应用于临床或现场即时诊断检测AMI。在本论文中,制备并优化设计了一种脂质修饰磁珠作为心肌细胞释放外泌体的捕获探针,首次建立并验证了一种基于等温扩增和荧光免疫层析试纸条的miRNA-208a定量检测方法,并选取31例AMI患者和23例健康者的血液样本进行验证,证明了miRNA-208a和目前临床“金标准”的cTnI具有显著的正相关性,本研究为miRNA-208a作为AMI分子标志物进行临床应用奠定了基础。论文主要工作如下:1)基于磁珠提取外泌体的方法建立。制备了两种不同的脂质磁珠捕获探针,实验结果显示出脂质磁珠捕获探针具备优异的分散性、稳定性以及强的细胞/外泌体捕获能力,磁响应时间小于20 s。在捕获实验中,通过优化脂质与磁珠的投料量、磁珠捕获环境等因素,表明磁珠:NH2-PEG-CLS:NH2-m PEG投料质量比10:1:3为最优制备方案。制备的MB@PEG-CLS/m PEG磁珠（胆固醇磁珠）与MB@PEG-DSPE/m PEG磁珠（DSPE磁珠）对细胞与外泌体表现出不同的捕获效果。使用外泌体表面标志蛋白CD9对脂质磁珠捕获的外泌体进行免疫荧光标记,验证了外泌体被DSPE磁珠捕获,为后续利用外泌体提取并检测miRNA-208a奠定了基础。2)链交换等温扩增联合横向流荧光免疫检测（SEA-LFIA）试纸条测定miRNA-208a的方法学建立。建立了基于一对引物的链交换等温扩增方法,通过优化反应温度、反应时间等条件,能够在30 min内实现对miRNA-208a的等温扩增。SEA方法的准确性经酶切鉴定进一步验证。利用横向流荧光免疫检测试纸条及荧光定量分析仪,建立的SEA-LFIA方法可灵敏、特异性地检测miRNA-208a,并且检测结果可实现数字化定量,其检测灵敏度为1 pmol。3)SEA-LFIA检测方法的临床样本验证与相关性分析。使用临床采集的31例AMI发生后新鲜血液样本,通过对样本的cTnI浓度与SEA-LFIA方法测出的荧光信号值进行相关性分析,表明SEA-LFIA方法检测miRNA-208a的荧光信号值与cTnI浓度之间存在正相关关系,其相关系数r达到0.677。通过ROC曲线分析,建立的SEALFIA方法检测miRNA-208a的AUC为0.986,当荧光信号值>1543时,检测miRNA-208a的灵敏度为100%,特异性为91.3%。在8例cTnI浓度高于临界值、但非AMI患者来源的血液样本中,并没有检测到miRNA-208a的存在,表明miRNA-208a具有更佳AMI诊断价值。这些结果表证明了建立的SEA-LFIA方法的可靠性及miRNA-208a作为AMI的分子标志物的可行性。
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