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目的：建立人胰腺癌耐吉西他滨（Gemcitabine，GEM）细胞株，为研究胰腺癌化疗过程中产生获得性耐药机制的研究提供细胞模型；初步探讨南瓜蛋白（cucurmosin，CUS）可能的作用机制，并观察其诱导细胞增殖抑制及逆转耐药的能力，为CUS潜在的抗胰腺癌作用临床应用提供理论基础和实验依据，进而为治疗胰腺癌提供新方法。方法：1、建立耐药株：用GEM以浓度梯度递增诱导法及克隆化培养建立胰腺癌耐GEM细胞株PANC-1RG7。2、鉴定耐药株：光镜、电镜观察形态和超微结构；细胞计数法绘制细胞生长曲线，计算倍增时间；流式细胞仪（FCM）测定细胞周期；磺酰罗丹明B（SRB）法检测GEM、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶呤（MTX）、长春新碱（VCR）、吉非替尼（GEF）、顺铂（DDP）及5–氟尿嘧啶（5-FU）的半数抑制浓度（IC50），计算耐药指数（RI），观察是否存在交叉耐药；建立裸鼠皮下种植瘤模型，体内观察GEM的抑制率；实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）法及Western blot法检测已知耐药相关基因及蛋白的表达，如多药耐药基因（MDR1）及其蛋白产物P–糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、乳腺癌耐药蛋白（BCRP），及已被认为与胰腺癌耐药相关的脱氧胞苷激酶（dCK）、脱氧胞苷脱氨酶（CDA）、5’–核苷酸酶（NT5）、平衡型核苷载体（ENT）、核糖核苷酸还原酶（RRM）、DNA聚合酶A（POLA）等；Western blot法检测细胞抗凋亡通路PI3K/Akt/mTOR信号转导通路靶点PI3K、Akt及mTOR的表达变化。3、蛋白质组学方法分析差异蛋白：用相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术初步分析其耐药细胞系与亲代细胞系间蛋白质表达的差异，生物信息学分析数据，探寻新的可能与耐药相关的蛋白。4、CUS机制的初步探索：Wesrten Blot法观察CUS干预PANC-1细胞后表皮生长因子（EGFR）及其下游信号通路各位点的表达变化，qPCR检测CUS干预后EGFR基因表达的变化。SRB及集落形成实验观察CUS与吉非替尼（GEF）联合应用对PANC-1的作用。5、CUS对耐药株的作用研究：透射电镜观察CUS作用后耐药细胞株形态和超微结构的改变；FCM测定CUS对耐药细胞株细胞周期的影响；SRB法观察CUS单用及与GEM联用对耐药细胞生长抑制率的影响，观察协同作用，计算逆转倍数及相对逆转效率；集落形成实验观察CUS与GEM联用对耐药株的作用；建立裸鼠皮下种植瘤模型，体内观察CUS对耐药细胞株的增殖抑制作用；Westernblot法观察CUS干预后耐药细胞蛋白表达的变化。结果：1、成功诱导建立人胰腺癌耐药细胞株PANC-1RG7细胞，能够耐受2μmol/LGEM3天以上，并可正常增殖、传代；2、PANC-1RG7细胞具有特殊的形态学变化，明显区别于亲本细胞；生长明显缓慢（p<0.05）；细胞周期无显著性改变（p>0.05）；对GEM的耐药指数达39.9，并存在对MTX、GEF、DDP及5-FU不同程度的交叉耐药性；GEM对PANC-1RG7肿瘤的体内生长抑制作用明显减弱（p<0.05）；CDA、MRP及BCRP基因表达均明显降低（p<0.05），余检测基因无显著变化；NT5、RRM1、RRM2蛋白表达增高（p<0.05），余检测蛋白表达无显著变化。3、ITRAQ技术检测出差异显著（p<0.05）的蛋白共261个，参与了蛋白折叠、细胞骨架组装、翻译转录、一些蛋白复合体的合成和组装、葡萄糖合成、核苷酸有关的延伸功能等生物学过程，涉及多条能量、遗传物质代谢通路及IL22可溶性受体信号通路。4、CUS干预后，PANC-1细胞中所检测的EGFR、Akt、mTOR、PI3K、ras及c-raf的蛋白表达量均降低，EGFR基因水平表达无变化。联合应用低剂量的CUS与GEF长时间干预PANC-1细胞显示出协同作用。5、电镜下可见CUS干预PANC-1RG7细胞后明显凋亡改变；FCM检测细胞周期无显著性改变，但可见凋亡峰出现；SRB测得CUS干预PANC-1及PANC-1RG7细胞96h的IC50值分别为0.0535±0.0100及0.0318±0.0090μmol/L，GEM与CUS联用仅呈单独相加作用，不存在协同或拮抗作用；0.007813μmol/L浓度CUS的逆转倍数及逆转效率分别为1.78±0.65及50.13±16.87%；集落形成实验观察GEM与CUS联用效应也仅呈单独相加作用；CUS对耐药细胞株PANC-1RG7的体内抑制作用较其亲本细胞PANC-1更强；CUS干预后，RRM1、RRM2、PI3K、Akt及mTOR蛋白表达均明显下调，呈浓度依赖性。结论：1、GEM浓度梯度递增法诱导建立的胰腺癌耐药细胞株PANC-1RG7具有独特的形态学、生物学特点，可能是通过RRM1、RRM2蛋白过表达而获得耐药性的。2、人胰腺癌细胞株PANC-1及其耐GEM细胞株PANC-1RG7的表达差异蛋白共261个，参与了多项生物学过程，涉及多条能量、遗传物质代谢通路以及IL22可溶性受体信号通路。3、CUS能够妨碍EGFR下游Ras/Raf通路及PI3K/Akt/mTOR通路的信号转导，从而诱导细胞凋亡。4、CUS能够增加EGFR靶向药物GEF的敏感性。5、CUS能够通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路诱导PANC-1RG7细胞凋亡，且在体内外均可抑制细胞增殖，其作用较其亲本细胞PANC-1更为明显。6、CUS与GEM联合应用呈现相加作用，低浓度CUS可部分逆转PANC-1RG7细胞对GEM的耐受性，其机制可能为CUS在蛋白水平上对RRM1、RRM2表达的下调作用。