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脑胶质瘤是原发性脑肿瘤最常见的类型,每年的2/3胶质瘤是恶性的胶质瘤约占颅内相关肿瘤致残和致死率的很大部分比例,尽管目前各种治疗方法取得了的很大进步,但是对于胶质母细胞瘤患者来说即使进行包括手术、放疗、化疗等综合治疗,但是其2年生存率还不到30%。对低级别胶质瘤(WHOI/II)病人虽然能取得相对较好的愈后,但也是无法治愈低级别胶质瘤。因此阐明胶质瘤的发生发展机制寻找新的关键分子治疗靶点尤其特别重要。我可前期基因芯片研究结果显示Stathmin在胶质瘤中表达呈现高水表达,目前已有很多报道Stathmin在多种肿瘤组织中表达上调,目前关于Stathmin在胶质瘤中的研究很少。本课题通过观察Stathmin在正常脑组织、不同病理级别脑胶质瘤以及胶质瘤细胞株中的表达情况,并通过研究Stathmin在胶质瘤细胞株中的表达,深入研究Stathmin在胶质瘤发生发展过程中的作用机理。实验共分为三个部分:第一部分,观察在脑胶质瘤组织中Stathmin蛋白和mRNA表达水平及其与胶质瘤临床特征的相关性,应用回归分析Stathmin的表达水平与胶质母细胞瘤患者生存时间的关系;第二部分,观察Stathmin在U251和U87脑胶质瘤细胞株中的mRNA和蛋白表达水平;第三部分,通过靶向RNA干扰抑制Stathmin基因在胶质瘤细胞株内表达,观察其对U251胶质瘤细胞株生长、增殖、凋亡作用机制.以及靶向StathminSiRNA抑制Stathmin表达后对化疗药CCNU、TMZ敏感性的影响。因此,探讨Stathmin参与脑胶质瘤发生发展以及恶性转化的作用机制,有助于了解Stathmin在胶质瘤作用机理,为胶质瘤的临床治疗提供新的治疗靶点。一脑胶质瘤中Stathmin的表达和临床特征相关性及胶质母细胞瘤患者生存分析目的:研究Stathmin在脑胶质瘤组织中表达水平及其与胶质瘤患者临床特征的相关性,Stathmin蛋白表达水平与胶质母细胞瘤患者生存时间的关系。方法:采用免疫组化染色和Western blot检测5例正常脑组织和63例不同级别脑胶质瘤中Stathmin蛋白的表达。选用手术治疗并且术后同一化疗和放疗方案28例胶质母细胞瘤患者,利用生存分析检验Stathmin表达水平同患者生存时间的相关性。然后用实时定量PCR检测5例正常脑组织和34胶质瘤组织中mRNA在的表达水平。并分析Stathmin表达水平同胶质瘤患者临床特征的相关性。结果:Realtime-PCR检测Stathmin mRNA在34例不同级别脑胶质细胞瘤和5例正常脑组织中的表达,结果发现Stathmin mRNA表达水平在胶质瘤组织中明显高于正常脑组织(P<0.01)。并且,Stathmin mRNA水平在高级别胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别胶质瘤(P<0.01)。Western blot法测定Stathmin蛋白在5例正常脑组织和63例不同级别胶质瘤中的表达,结果发现Stathmin蛋白在胶质细胞瘤组织中表达明显上调,与正常脑组织相比差别显著(P<0.01)。Stathmin在高级别胶质瘤(WHOIII/IV)表达最高,其次是低级胶质瘤(WHOI/II)中表达量稍低,在正常脑组织中Stathmin表达量最低差异显著(P<0.01),高级别胶质瘤与低级别胶质瘤Stathmin蛋白的表达量相比显著升高(P<0.01)。采用免疫组化法检测了5例正常脑组织及63例人脑胶质瘤石蜡标本中Stathmin蛋白的表达情况。结果发现正常脑胶质细胞Stathmin蛋白染色为阴性,63例胶质瘤标本中44例可见Stathmin蛋白的阳性表达。脑胶质瘤的临床病理级别与Stathmin表达呈正相关关系(P<0.01),与性别和年龄无关(P>0.05)。生存分析表明,Stathmin表达水平同胶质母细胞瘤患者生存时间成负相关(p=0.022)。结论:Stathmin在脑胶质细胞瘤可表达水平同脑胶质瘤的级别呈明显相关,胶质母细胞瘤中于与患者的生存时间呈负相关。第二部分Stathmin在U87、U251胶质母细胞瘤细胞株中的表达目的:研究Stathmin在胶质瘤细胞株U87和U251中的mRNA和蛋白表达水平。方法:使用RT-PCR、Western blot和免疫荧光法检测Stathmin基因在U87和U251细胞株的mRNA和蛋白表达水平。结果: RT-PCR结果发现StathminmRNA表达水平在U87和U251细胞株中高于正常脑组织(P<0.01)。Western blotting法测定U87和U251细胞株中的表达,结果表明:Stathmin蛋白在U87/U251表达明显高于正常脑组织((P<0.05),免疫荧光证实Stathmin在U251和U87胶质瘤细胞株胞浆表达。结论:在U251和U87细胞株中StathminmRNA和蛋白表达水平明显高于正常脑组织。第三部分靶向StathminSiRNA抑制Stathmin表达对胶质瘤细胞株细胞生长、增殖、凋亡的作用及其对TMZ和CCNU化疗敏感性的影响目的:研究通过SiRNA抑制U251中Stathmin表达,观察对细胞株生长、增殖、凋亡的作用及其对TMZ和CCNU化疗敏感性的作用。方法:利用RNA干扰抑制U251细胞株内Stathmin的表达并加入CCNU和TMZ作用后。观察细胞生长,MTT法测定细胞增殖。流式细胞仪及Hoechst 33258染色检测细胞周期和细胞凋亡。Western blot测定靶向StathminSiRNA抑制Stathmin表达的细胞株TrailR1/2,Bax,Bcl-2,,P53,survivin,MDR1,MRP等蛋白表达水平变化。结果:转染Stathmin siRNA可有效导致U251细胞内的Stathmin表达。抑制了Stathmin表达的细胞株同未转染组相比,其生长、增殖明显降低(p均<0.01),并能增强U251对化疗药CCNU和TMZ的敏感性。经流式细胞仪及Hoechst 33258染色检测,StathminsiRNA转染后U251的凋亡率较对照组明显增加(p<0.01),细胞周期阻滞在M2期(p<0.01)。U251细胞株Stathmin表达抑制后, Western blot证实p53,Bax和TrailR1/2表达均明显增加,而Bcl-2,Survivin,MDR1,MRP等蛋白表达无显著变化。结论:敲除Stathmin表达可抑制肿瘤细胞的生长、增殖,并促进胶质瘤细胞的早期凋亡。同时,靶向StathminSiRNA抑制Stathmin表达能增强U251对化疗药CCNU和TMZ的敏感性,导致肿瘤凋亡相关性蛋白p53,Bax和TrailR1/2表达明显增加,可见,Stathmin促进肿瘤生长增殖。抑制Stathmin表达可能作为未来胶质瘤靶向治疗的选择之一。