论文部分内容阅读
细胞的生长、分化、代谢和病变等重要的生物学过程都受到蛋白质合成的调控,蛋白质代谢的动力学行为通常可以用来表征细胞的状态,因此发展合适的方法来观测活细胞内新生成蛋白质的动态变化至关重要。经过多年的发展,生物正交反应已经成为标记和检测细胞内新生成蛋白质的重要工具,但活细胞内新生成蛋白质的动态成像依然面临着一些问题。本论文旨在建立新方法,合成新探针,实现活细胞新生成蛋白质的成像和分析。主要的研究内容包括以下三个部分:1.基于生物正交标记的方法,利用含炔基的有机小分子探针与叠氮氨基酸之间的CuAAC反应对细胞内的新生成蛋白质进行标记,优化条件得到最佳的标记成像效果。我们对抗癌药物bortezomib刺激前后的正常细胞和癌细胞进行了成像检测,通过分析新生成蛋白质的空间分布和含量,研究了细胞蛋白质生成的规律。从时间和空间两个维度对正常细胞和癌细胞蛋白质合成动力学差异进行了比较,研究药物干预前后,正常细胞和癌细胞蛋白质合成动力学的变化和差异。据此,我们可以实现正常细胞和癌细胞的区分,并对药物的作用机制和疗效进行评价。2.针对CuAAC反应在活细胞荧光强度成像中存在的问题,我们发展了寿命成像模式,设计合成了一种新型的含有炔基的铱配合物探针。这种探针不仅有近红外发射、长寿命、较强的抗光漂白性和良好的穿膜性,而且在click反应前后存在高达414 ns的寿命变化。反应前后寿命的巨大差异有助于区分结合探针和游离探针。我们还优化了click反应的催化剂,用氧化亚铜纳米粒子替换传统一价铜催化剂,达到了高效低毒的活细胞click标记的效果,实现了活细胞内新生成蛋白质的动态免洗成像。3.基于寿命成像的优点,我们设计合成了四种新型的阳离子铱配合物探针,并选取其中性能较好的Ir-OMe探针用于活细胞微黏度检测。该探针不仅有近红外发射、长寿命、较强的抗光漂白性和良好的穿膜性,而且其寿命对黏度的变化非常敏感,随着黏度增大,分子的发光寿命会急剧增加。基于这些性质,我们实现了活细胞微黏度的成像检测,比较了药物刺激下正常细胞和癌细胞内的黏度变化,并对细胞凋亡过程中细胞内黏度变化进行了动态的检测。