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第一部分:体外培养中脑腹侧神经元及纹状体神经元基因表达的性别差异研究 目的:帕金森病(PD)是一种由于黑质致密部的神经元退行性变导致纹状体多巴胺(DA)耗竭，危害老年人健康的第二大神经性疾病。目前PD的病因和发病机制尚未完全明确。之前的研究发现许多基因的表达与PD相关。流行病学调查表明PD的发病率男性高于女性。这种性别差异是由遗传因素还是环境因素导致尚存在争议。我们检测了不同性别的体外培养的黑质纹状体通路中两个重要部位腹侧中脑(VM)和纹状体神经元的基因表达情况，以期获得一些线索来揭示PD发生性别差异的病理机制。 方法:我们分离培养来自不同性别的Balb/c鼠的VM神经元及纹状体神经元，培养来自新生小鼠中脑的星形胶质细胞和小胶质细胞。用RT—PCR方法检测基因表达。这些基因包括:(1)与DA能神经元发育相关的，与DA合成、摄取、代谢、降解有关的基因;(2)神经生长因子及其受体的基因;(3)已证明与PD直接相关的基因;(4)与凋亡及溶酶体功能相关的基因;(5)与雌激素受体(ER)相关的基因。细胞分成三组:未处理组，应激组及雌激素预处理加应激组。 结果:大部分我们所研究的基因都不是神经元特异的基因，它们在星形胶质细胞中也有表达，而较少在小胶质细胞上表达。在VM神经元上表达的基因除DBH外，在纹状体神经元均有表达。而Darpp32和D3则较特异地仅在纹状体神经元上表达。我们在VM神经元上检测到Pitx3/D2/DAT/MAO-A的表达有性别差异，在纹状体神经元上BDNF/GDNF的表达有性别差异。同时ER-beta的表达在VM神经元及纹状体神经元上均有性别差异。应激及雌激素预处理影响这些基因的表达。 结论:有一些基因，包括ER-beta的表达在VM神经元及纹状体神经元上存在性别差异，这些基因的表达受雌激素及应激的影响。这些结果提示:VM神经元及纹状体神经元基因表达的性别差异是它们本身内在属性，应激处理、应激前雌激素预处理两种情况下基因表达的变化及雌激素受体性别差异的存在也表明这种性别差异很有可能受到体内外环境包括雌激素水平的调节。 第二部分:Nurr1在原代培养的中脑小胶质细胞中的表达及其调控 目的: Nurr1是一个主要在中枢神经系统中表达的、对中脑DA神经元的成熟与分化起重要作用的转录因子。本研究的目的是证实Nurr1是在原代培养的小鼠中脑小胶质细胞中表达并试图了解其表达的调控方式。 方法:用PCR方法证明Nurr1 mRNA水平的表达;用Western blot方法证明Nurr1蛋白水平的表达;用免疫荧光染色标记法证实Nurr1在细胞的定位;用细菌脂多糖(LPS)激活小胶质;用信号传导通路MAPK/ERK、JNK、P38MAPK及PI3K/Akt的特异性抑制剂来调查这些信号传导通路是否参与了Nurr1表达的调控。 结果: Nurr1在培养的小胶质细胞中有mRNA及蛋白水平的表达，且其蛋白在细胞的胞核及胞浆都有分布。在LPS处理后Nurr1的表达显著增高，并且这种表达可被ERK、JNK及PI3K/Akt的抑制剂部分阻断，但不受P38抑制剂的影响。并且ERK抑制剂能部分阻止Nurr1蛋白从胞浆到胞核的移位。 结论:Nurr1在培养的小胶质细胞中表达。在小胶质细胞被LPS激活后，Nurr1的表达升高，并且其蛋白从胞浆转移到胞核。ERK、JNK及PI3K/Akt参与了Nurr1的表达和调控。 第三部分:溶酶体酶Cathepsin D在锰对原代培养中脑星形胶质细胞毒性中的作用 目的:星形胶质细胞是锰神经毒性首要的靶细胞。但锰对星形胶质细胞的毒性作用的相关机制尚不清楚。本研究的目的是观察锰处理后星形胶质细胞超微结构的变化，溶酶体及溶酶体水解酶（Cathepsin D）在锰毒性反应中所发生的作用，并初步探讨溶酶体在锰毒性下对星形胶质细胞的保护作用。 方法:用DAPI/PI/AO染色观察锰处理后培养的星形胶质细胞的死亡;用电镜观察锰处理后细胞超微结构的变化;用AO及线粒体、溶酶体探针染色观察线粒体及溶酶体数目及功能变化;用Western blot方法检测Cathepsin D及Bax蛋白水平变化;结合免疫荧光染色方法及线粒体溶酶体探针共染色检测Cathepsin D及Bax蛋白在锰处理后的细胞内定位的变化;用pepstatin A抑制Cathepsin D的活性。 结果:锰处理后，星形胶质细胞出现多种细胞死亡形式，包括凋亡、坏死及类凋亡。伴随细胞死亡的同时还观察到胞浆内广泛的空泡化、线粒体肿胀、溶酶体数目增多和膜稳定性下降。而且，我们证明了锰处理后Bax蛋白与溶酶体或线粒体的共定位明显增加，Cathepsin D从溶酶体内释放。锰处理明显提高Cathepsin D蛋白水平，Cathepsin D抑制剂预处理增加细胞死亡。 结论:锰毒性诱发培养的星形胶质细胞多种形式的死亡。溶酶体及Cathepsin D在锰毒性中可能起关键的作用。这有助于增进对与锰毒性相关的神经性疾病机制的认识。