论文部分内容阅读
肺癌细胞的生物学发生是一个十分复杂的过程。寻找有效的抗癌方法与途径,在肺癌的发生阶段可以修复细胞成分的早期改变,肺癌形成之后能够清除突变或者损伤了的细胞器,甚至在肺癌形成后逆转肺癌细胞一直是近年来的研究热点。近年来的研究显示:细胞器的代谢主要依靠自噬途径。在生命的进化过程中,自噬是一个古老的生物学现象,广泛存在于植物和其它较低级生命体中,是生物降解胞内蛋白,完成细胞器转化,保持内环境稳定的重要方式,也是哺乳动物清除癌细胞的手段之一。自噬是一个有大量小分子蛋白质参与的生物学过程,人类自噬过程中比较明确的和研究较多的是Beclin1基因和其编码蛋白。自噬体形成必需的微管相关蛋白轻链3 (MAPLC3)也常常用于自噬体的检测。出于维持细胞内环境稳定的目的,正常情况下细胞自噬的基础水平保持在一个较低的状态,在某些“危机”状况下可以快速上调,如:生长激素缺乏、饥饿、细胞重建、细胞内出现过多的受损细胞器或代谢废物等。自噬受两种进化中形成的营养感受器调节:TOR激酶(target of rapamycin (TOR) kinase)在营养充分时关闭自噬信号,真核起始因子2激酶Gcn2(eukaryotic initiation factor 2 (eIF2 ) kinase Gcn2)及其下游靶位Gcn4-自噬基因的转录反式作用子,在饥饿时启动自噬信号。TOR激酶的下游是一些编码ATG蛋白的基因,参与自噬的发生,融合,成熟,再循环。雷帕霉素是TOR受体的拮抗剂,因此能够上调自噬。另外较常用3甲基腺嘌啉(3MA)抑制自噬。自噬和癌细胞的形成、转化、治疗敏感性密切相关。癌细胞形成早期刺激自噬能够清除受损细胞器,分解细胞内过多的有害物质(如过氧化物等),阻止正常细胞向癌细胞转化,调控自噬的表达和化疗药物联合对肿瘤细胞的生长有协同或拮抗作用,表现为与单纯用化疗药物相比,调控自噬表达后肿瘤细胞的凋亡率发生了变化。在化疗或放疗中抑制自噬有可能导致癌细胞无法清除受损细胞器,加速细胞死亡,强化治疗效果。为了研究自噬和非小细胞肺癌的关系,以及调节自噬的表达可能产生的放疗增敏效果,我们检测了经手术切除的非小细胞肺癌(NSCLC)临床标本中的自噬相关基因表达状态,探讨自噬的表达情况和NSCLC发生和发展的可能关系;观察了肺癌细胞系A549在γ射线照射下自噬和自噬上游信号传导系统的改变;研究了改变肺腺癌细胞系A549中自噬表达后,A549细胞对于放射治疗敏感性的变化以及自噬相关通道蛋白和一些耐药基因改变,检验肿瘤细胞周期和凋亡率,进而对其机制进行探讨,探究自噬与凋亡的内在联系和在程序性细胞死亡(PCD)的作用和意义。本研究中,我们采集了2006年4月至2006年10月武汉协和医院胸外科手术切除的非小细胞肺癌新鲜标本72例,冰冻病理切片免疫荧光染色检测肺癌组织,癌旁组织,正常组织中自噬特异性基因Beclin1和MAPLC3表达;提取总蛋白和总RNA,采用Westernblot和RT-PCR检测Beclin1和MAPLC3蛋白表达和mRNA转录情况并且进行半定量分析。培养肺腺癌细胞系A549,对其采用γ射线照射,检测在射线作用下自噬相关蛋白和mRNA以及上游akt和mTOR的表达。用3甲基腺嘌呤(3-methyladenine 3MA)和雷帕霉素(Rapamycin)改变其自噬的表达(3MA抑制自噬表达,Rapamycin则上调自噬表达),收集细胞后检测不同自噬表达状态下其抑制率和细胞凋亡率,以及细胞周期改变情况;细胞集落试验检测不同自噬表达情况下射线对细胞增殖的抑制情况;Western blot检测MAPLC3、pakt、mTOR、COX2等蛋白表达,RTPCR检测MAPLC3、survivin、mTOR、Bcl-2、EIF-4E的mRNA转录情况水平。Beclin1和MAPLC3免疫荧光染色流式细胞检测A549细胞自噬相关蛋白表达率,分析凋亡和自噬在PCD中的关系。对NSCLC临床切除标本免疫荧光染色和蛋白mRNA检测显示, Beclin1和MAPLC3在肺癌组织中表达低于在癌旁组织和非癌组织,而癌旁组织和正常组织中表达差异无统计学意义。γ射线能够上调A549细胞自噬的表达,且呈时间依赖性。3MA和rapamycin的自噬调节效果明显,3MA和放疗有拮抗作用,而rapamycin则有协同放疗作用,抑制自噬可能通过部分凋亡相关蛋白的改变和细胞周期的阻滞作用影响放疗效果。本课题组对自噬和肺癌的关系做了一系列研究,有了一些新的发现。但是由于时间的关系,我们的实验尚局限于较浅的层面,在今后的工作中我们会作进一步深入研究。第一部分自噬相关基因在NSCLC中的表达目的:研究发现自噬相关基因表达的下调和肿瘤的发生关系密切。本研究检测人小细胞肺癌标本中自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3 MAPLC3)的表达并探讨其意义。方法:采用免疫荧光染色,逆转录-聚合酶链法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction RT-PCR)和Western blot法检测肺癌组织,癌旁组织,正常肺组织的Beclin1和MAPLC3蛋白、mRAN表达。结果:免疫荧光染色显示Beclin1在肺癌组织中表达较低,阳性率为8.3%,在癌旁组织和正常组织阳性率均为100%(Χ2=199.40,p=0.00);MAPLC3在肺癌组织中表达阳性率为13.9%,在癌旁组织和正常组织阳性率均为100%(Χ2=182.75,P=0.00)。Beclin1 mRNA在肺癌组织中的相对表达量(1.30±0.07),与在癌旁组织(1.69±0.10)及正常组织中(1.67±0.08)的相对表达量比较差异有统计学意义(F=6.6, P= 0. 00);MAPLC3mRNA在肺癌组织中相对表达量(4.55±0.31),与在癌旁组织(6.73±0.37)及正常组织(6.90±0.37)中的相对表达量比较差异亦有统计学意义(F=14.1,P=0.00)。Western blot检测Beclin1蛋白在肺癌组织中的相对表达量(3.49±0.29),和癌旁组织(5.31±0.46),正常组织(6.33±0.58)中的相对表达量比较差异有统计学意义(F=9.73,P<0.01),MAPLC3蛋白在肺癌组织中的相对表达量(2.43±0.26),和癌旁组织(3.12±0.28),正常组织(3.41±0.30)中的相对表达量比较差异也有统计学意义(F=3.22,P=0.04)。结论:自噬相关基因Beclin1和MAPLC3的mRNA及蛋白在正常肺组织和肺癌组织内均有表达,表达的相对量在肺癌组织中较癌旁组织和正常组织低,在癌旁和正常肺组织中表达接近。第二部分放射治疗对A549细胞自噬及其相关基因和自噬上游信号传导途径的影响目的:为了探讨γ电离辐射对于肺癌细胞A549的影响,本试验检测了γ射线照射不同时间后A549细胞自噬相关基因Beclin1和MAPLC3的表达和细胞周期改变,同时检测了自噬上游信号传导通道PI3K/AKT相关蛋白和mRNA的改变,并讨论其机制。方法:设立对照组和照射后不同时间取材的试验组,采用细胞免疫荧光染色镜下计数检测照射不同时间后Beclin1、MAPLC3、pakt、mTOR的阳性细胞表达率,PI染色流式细胞仪检测照射不同时间后细胞周期的改变。RT-PCR和Western blot检测Beclin1、MAPLC3、pakt、mTOR的mRNA和蛋白表达。结果:免疫荧光染色显示,未经照射的肺腺癌细胞系A549自噬相关蛋白免疫荧光阳性率较低(Beclin1:0.13±0.04,MAPLC3:0.25±0.05),自噬相关信号传导通道蛋白基础表达率也较低(mTOR:0.09±0.03,pakt:0.03±0.01),照射后上升,20h达到高峰后则较平稳(Beclin1:0.39±0.09;MAPLC3:0.59±0.12;pakt:0.09±0.02.较对照组均改变明显,P<0.05)。PI染色显示随照射后时间增加,细胞凋亡率逐渐增加,(照射前1.5%,照射后20h 3.3%),射线照射后A549细胞G2-M期细胞增多(照射前24.9%,照射后53.0%),S期细胞减少(照射前22.3%,照射后13.3%)。免疫荧光染色流式细胞仪检验自噬相关蛋白Beclin1和MAPLC3以及自噬相关信号传导途径蛋白akt和mTOR的表达:检验结果与免疫荧光染色共聚焦显微镜检验结果相似。射线照射后自噬相关基因Beclin1,MAPLC3,pakt蛋白和mRNA的表达水平都有所上升,随照射后时间推移上升明显。但是akt和mTOR蛋白和mTORmRNA表达水平没有明显改变。结论:在γ射线的作用下,A549细胞内出现了自噬相关基因Beclin1和MAPLC3上调的情况,距照射时间越久,上升越明显,同时γ射线对A549细胞产生了G2-M期阻滞,增加了细胞的凋亡率,减少S期细胞。射线也造成了自噬上游信号pakt表达的上调。第三部分调节A549细胞自噬的表达对其放疗敏感性的影响及机制探讨目的:探讨3-MA和rapamycin对于A549细胞的不同作用,研究通过药物调节A549细胞自噬表达后对于放疗效果的影响,进而讨论其机制。方法:分为对照组,单纯放疗组, 3MA治疗组,rapamycin治疗组,3MA联合放疗组,rapamycin联合放疗组;MTT法检测rapamycin和3MA细胞毒性;细胞集落试验检测各组细胞集落数和存活分数;采用免疫荧光染色细胞计数检测各组Beclin1, MAPLC3, pakt,mTOR蛋白表达;流式细胞仪检测每组细胞周期和Beclin1,MAPLC3,PAKT,mTOR蛋白表达率;RT-PCR检测MAPLC3,survivin, mTOR,Bcl-2,EIF-4EmRNA表达;Western blot检测MAPLC3、pakt、mTOR、COX2蛋白表达结果:MTT法研究发现:3MA IC10:10Mm,rapamycin IC10:20nM。3MA单独使用时抑制了A549细胞自噬相关基因Beclin1,MAPLC3和pakt的表达,降低了细胞的凋亡率和COX2蛋白表达,对于Survivin,Bcl-2,eIF-2E的mRNA也有一定的抑制作用;rapamycin单独使用时提高了Beclin1,MAPLC3和pakt蛋白的表达率,降低了细胞的凋亡率mTOR蛋白表达,抑制eIF-2E的mRNA;3MA联合放疗组Beclin1,MAPLC3和pakt的表达下降,细胞的凋亡率和G0-G1期细胞明显上升,细胞集落试验显示存活分数明显下降, COX2蛋白表达下降, Bcl-2,eIF-2E mRNA转录减少;rapamycin联合放疗组Beclin1,MAPLC3和pakt的表达上升,细胞的凋亡率明显减少,G2-M期细胞明显上升,细胞集落试验显示存活分数明显增加,mTOR蛋白表达下降, mTOR和eIF-2E mRNA转录减少,Bcl-2增加。结论:3MA抑制自噬,rapamycin上调自噬的表达;3MA对于放疗有协同作用,rapamycin对于放疗有拮抗作用;3MA放疗协同作用其机制可能与其抑制自噬体的产生,促进细胞凋亡,以及G0-G1期阻滞有关。