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微囊藻毒素(microcytstins,MCs)是由蓝藻产生的且具有肝毒性的小肽内毒素,可诱发肝炎并促发肝癌,对易感人群健康存在极大威胁。本实验通过研究MCs对人肝癌细胞HepG2肝癌相关的原癌基因及抑癌基因表达的影响,探讨该毒素诱导肝炎/肝癌的机理,为毒素暴露人群健康的防护提供理论支撑。本研究采用常规细胞毒性实验方法,用纯毒素MC-LR对HepG2细胞进行染毒处理,MTT法检测细胞活力,以确定该毒素的细胞毒性。根据细胞毒性及其细胞活力实验结果,我们选择MC-LR的非细胞毒染毒浓度为0 n M、10 n M、50 n M、0.5μM、10μM、50μM;染毒时间分别为8 h、24 h、48 h和72 h。细胞染毒处理结束后,收集HepG2细胞、提取总RNA并进行逆转录PCR;然后用q PCR检测与肝癌相关的原癌基因c-Met、c-fos、c-jun、c-myc、N-ras及抑癌基因PTEN转录水平的表达情况。同时,采用Western blot方法检测上述基因蛋白水平的表达。本研究所获得的主要实验结果有如下3个方面。1.MTT检测结果和MC-LR的细胞毒性用MC-LR处理HepG2细胞8 h、24 h时,MTT检测发现,染毒组和对照组之间对比发现细胞活力无统计学差异。处理48 h时(除100μM组)染毒组细胞活性虽有所降低,但与对照组相比仍无明显差别。仅100μM MC-LR暴露48 h后,细胞活力与对照组相比显著下降。2.MC-LR对HepG2细胞原癌基因及抑癌基因转录水平表达的影响HepG2细胞经MC-LR染毒处理后,qPCR检测发现,原癌基因c-Met的相对表达量(m RNA水平)随MC-LR处理剂量的增加及处理时间的延长而显著上升,且高浓度组较低浓度组上升更明显。该实验结果说明,MC-LR染毒明显促进HepG2细胞中原癌基因c-Met的表达。原癌基因c-fos转录水平经MC-LR染毒8 h时即明显上调,且均达到最高峰。染毒24 h、48 h和72 h时,上调情况有所下降。因此,MC-LR染毒也明显促进HepG2细胞原癌基因c-fos的表达,而且染毒浓度越高,促进作用越明显。原癌基因c-jun的mRNA水平在MC-LR处理8 h时,各浓度组和对照组相比均显著上升,并且随着染毒剂量的加大而升高。处理24 h时持续上调但高浓度组相对于低浓度组升高更为明显,且各染毒组均上调到最高峰。48 h和72 h各浓度组仍然上调,但上调幅度下降。该实验结果说明,MC-LR染毒明显促进HepG2细胞中原癌基因c-jun的表达。MC-LR染毒8 h时,各浓度组细胞c-myc的转录水平均较对照组升高并达到最高峰。24 h、48 h和72 h时各浓度组c-myc表达仍显著上升,但相对于8 h情况有所下降。因此,c-myc的表达随着MC-LR暴露浓度的增加而显著上调。和对照组相比,各浓度MC-LR组(除10 n M组)HepG2细胞N-ras的表达经染毒8 h均显著上调。24 h时继续上调,48 h上调达到最高峰,72 h上调情况有所下降,且随染毒浓度增加而加强。该实验结果表明,MC-LR染毒明显促进HepG2细胞中原癌基因N-ras的表达。MC-LR染毒后,HepG2细胞抑癌基因PTEN的表达情况比较复杂。处理8 h和24 h比对照组明显下调,且高浓度组下调情况比低浓度组更为显著。48 h时仍显著下调,且0.5μM组、10μM组及50μM组下调达到最低水平。72 h时50 n M组、0.5μM组、10μM组及50μM组,表达均显著下调。该检测结果表明,MC-LR染毒明显抑制PTEN的表达。3.MC-LR对HepG2细胞中原癌基因及抑癌基因蛋白表达水平的影响Western blot检测结果表明,MC-LR染毒处理上调原癌基因c-Met、c-Fos、c-Jun、c-Myc及N-Ras的蛋白水平,但下调PTEN的蛋白水平。该结果与MC-LR对其转录的影响结果一致。本实验结果说明,采用非细胞毒浓度的MC-LR染毒HepG2细胞后,极低剂量的MC-LR能分别于转录及蛋白水平上调原癌基因表达且下调抑癌基因表达。该结果不仅说明HepG2细胞肝癌相关原癌基因及抑癌基因与MC-LR肝细胞毒性密切相关,而且在基因表达水平说明MC-LR引发肝炎/肝癌可能与该毒素诱导的原癌基因过表达及抑癌基因的表达抑制存在紧密联系。本研究结果对于揭示MC-LR所致肝炎/肝癌的机理及保护毒素暴露人群的健康具有一定的理论意义。