G1后期细胞易被Fas诱导凋亡的机制研究

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目的:  课题小组前期研究发现G1后期细胞易被Fas诱导凋亡,本研究通过Hoechst33342染料对细胞DNA进行染色,通过流式细胞仪分选出高纯度G0/G1期和S期细胞。分别测定G0/G1期细胞和S期细胞中抑制凋亡分子的表达来阐明G1后期细胞易被Fas诱导凋亡的机制。本研究的意义在于从分子水平阐明凋亡与细胞周期之间的内在关系,阐明细胞凋亡窗口期的分子机制。  方法:  利用Hoechst33342染料分别对MML-1、PEER淋巴瘤细胞进行DNA染色,通过流式细胞仪分选出细胞的DNA倍数不同的G0/G1期和S期细胞,对照组为未分选组。测定G0/G1期细胞、S期细胞和未分选组细胞Fas(终浓度50ng/ml)诱导凋亡(0hr、2hr、4hr)时的细胞凋亡率。通过超声裂解法提取G0/G1期细胞、S期细胞和未分选组细胞胞浆蛋白,Western blotting测定抑制凋亡分子FLIP、Bcl-2的表达。  结果:  (1) MML-1、PEER细胞Fas诱导凋亡时的细胞凋亡率结果:MML-1、PEER细胞G0/G1期及S期分别经Fas诱导凋亡0hr、2hr、4hr后测定细胞凋亡率。MML-1分选后S期细胞在Fas诱导凋亡0hr、2hr、4hr的凋亡率分别为27.8%,32.4%和45.4%;而分选后G0/G1期的凋亡率分别为18.9%,29.0%和30.3%。S期细胞较G0/G1期细胞易被Fas诱导凋亡。PEER分选后S期细胞在Fas诱导凋亡0hr、2hr、4hr的凋亡率分别为37.2%,52.8%和73.4%;而分选后G0/G1期的凋亡率分别为40.7%,48.2%和63.5%。从凋亡率可以判断S期细胞较G0/G1期细胞更易被Fas诱导凋亡。  (2)MML-1、PEER细胞FLIP蛋白表达结果:FLIP蛋白在G0/G1期细胞的表达较S期细胞、未分选组细胞显著增加,S期细胞和未分选组细胞的FLIP蛋白表达无明显差异。FLIP蛋白的表达在G0/G1期最高,细胞进入S期后表达降低。  (3)MML-1、PEER细胞Bcl-2蛋白表达结果:Bcl-2蛋白在G0/G1期细胞的表达较S期细胞、未分选组细胞显著降低,S期细胞和未分选组细胞的Bcl-2蛋白表达无明显差异。Bcl-2蛋白的表达在G0/G1期最低,细胞进入S期后表达增多。  结论:  本研究发现,S期细胞较G0/G1期细胞易被Fas诱导凋亡。细胞凋亡抑制分子FLIP蛋白水平在G1后期迅速下调,而分子Bcl-2蛋白水平在G1后期迅速回调。FLIP分子和Bcl-2分子的表达消长可能是G1后期细胞对Fas诱导的凋亡较为敏感的原因之一。
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