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目的: 通过免疫组化染色检测 TAGLN2在小鼠卵巢的表达,免疫荧光染色检测TAGLN2在小鼠卵母细胞中的表达水平,初步探讨TAGLN2与卵泡发育成熟的关系。 方法: 1实验动物3-4周龄和8周龄ICR清洁级雌性小鼠,体重在15-20g和25-35g。该小鼠购自广东省医学实验动物中心,饲养于广州医科大学实验动物中心,所有实验动物的操作及饲养均符合国家标准,遵循人道主义原则。动物许可证号:SCXK(粤)2013-0002。 2动物分组及处理 2.1随机选择4周龄小鼠,分成4组,每组至少8只。使用PMSG腹腔注射促排卵,HCG诱导卵泡成熟,分别在不同的促排卵时间段收集小鼠卵巢,通过免疫组化染色检测卵巢TAGLN2的表达。 2.2随机选择8周龄雌性ICR小鼠,分为3组,每组至少10只。使用PMSG腹腔注射促排卵,HCG诱导卵泡成熟,分别在不同的促排卵时间段收集小鼠卵母细胞(GV期卵母细胞、GVBD期卵母细胞、MII期卵母细胞),通过免疫荧光染色检测各组卵母细胞TAGLN2的表达。 2.3随机选取8周龄小鼠分3组,每组至少8只,对照组、卵巢注射miR-133b minic组及其阴性对照组,用Western-blot和实时定量PCR方法检测TAGLN2的下调效率;使用PMSG腹腔注射促排卵,HCG诱导卵泡成熟,分别统计各组小鼠获卵母细胞数。 2.4数据及图像采集:卵巢免疫组化每个切片100倍、200倍、400倍镜下各取5个视野;免疫组化切片和卵母细胞免疫荧光染色结果使用Image Pro Plus6.0图像分析软件分析TAGLN2的平均光密度值和平均荧光强度。用Nikon体视显微镜观察TAGLN2基因下调小鼠的卵母细胞,并统计各组小鼠卵母细胞数量。 结果: 1.免疫组化染色显示 TAGLN2在小鼠卵巢窦前卵泡、窦状卵泡、排卵前卵泡、黄体、闭锁卵泡和卵巢间质均有表达,且在卵巢中主要表达于颗粒细胞包膜以及胞浆。 2.免疫荧光染色结果显示TAGLN2在小鼠卵母细胞胞质中表达,GVBD期卵母细胞TAGLN2的表达水平显著低于GV期卵母细胞的表达水平(p<0.05),MⅡ期卵母细胞中TAGLN2的表达水平最低(p<0.05)。 3. miR-133b显著下调小鼠卵巢TAGLN2蛋白及mRNA的表达水平。miR-133b minic下调TAGLN2后,小鼠的GV期及MⅡ期卵母细胞数有增加趋势,但各组比较无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1. TAGLN2在小鼠卵巢中表达,在卵巢中主要定位于颗粒细胞膜和细胞质,卵母细胞胞质。 2. TAGLN2在小鼠不同发育期卵泡和卵母细胞中的表达水平具有差异性。 3. miR-133b可显著下调小鼠卵巢 TAGLN2蛋白及 mRNA的表达水平,TAGLN2下调后,小鼠卵母细胞数有增加趋势,TAGLN2的表达可能与卵泡发育成熟相关。